Task force cilena per il cancro gastrico (FORZA 1) (FORCE-1)

Entità partecipanti: La task force cilena per il cancro gastrico (GCTF) è uno sforzo collettivo tra due entità principali: 1- Il Centro di eccellenza della medicina di precisione (CEMP), che è stato istituito grazie a un finanziamento congiunto dell'agenzia governativa per lo sviluppo economico (Corporacion de Fomento de la Produccion, CORFO) e Pfizer Chile e 2- The Center UC for Investigation in Oncology (CITO) con sede presso la Pontificia Universidad Católica de Chile. Entrambe le entità sono organizzazioni di ricerca senza scopo di lucro volte a migliorare l'istruzione pubblica e implementare strategie per migliorare i risultati clinici nel trattamento oncologico e nella prevenzione del cancro.

Obiettivo primario: stratificare i pazienti cileni con GC in sottogruppi prognostici e correlare la risposta terapeutica in base alle alterazioni cliniche, proteiche, epigenetiche e genetiche in una coorte di 200 pazienti con GAC.

Obiettivi secondari

• Per determinare il profilo di mutazione nei pazienti cileni GC.
• Valutare la percentuale di pazienti con GC cileni che potrebbero beneficiare degli obiettivi drogabili attualmente disponibili (geni utilizzabili).
• Per correlare la presenza di EBV ai parametri clinici.
• Per valutare i livelli di espressione delle proteine ​​associate alle stratificazioni molecolari e alle terapie attualmente mirate (es. PD-L1 e antiangiogenetici)
• Determinare il profilo degli SNP nei geni DPYD e TYMS nei pazienti cileni con GC e la loro correlazione con gli eventi avversi.

Progettazione dello studio

Approvazione etica Il GCTF è uno studio non interventistico, collaborativo, prospettico non simultaneo che cerca di stratificare i pazienti GAC in base alla loro prognosi e risposta alla terapia. Lo studio rispetterà rigorosamente tutti i requisiti legali, i regolamenti e i principi generali stabiliti dalle agenzie internazionali che regolano la condotta etica nella ricerca biomedica su soggetti umani, seguendo le buone pratiche cliniche e la dichiarazione di Helsinki. Il protocollo dello studio GCTF è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Universitario (Pontificia Universidad Catolica de Chile, numero di approvazione CEC MED UC 16-046, delibera del 21 aprile 2016).

Reclutamento e caratteristiche dei pazienti I pazienti con GC diagnosticati saranno reclutati dalla rete Red UC Christus a Santiago, in Cile. Il reclutamento dei pazienti e la firma dei moduli di consenso informato, la manutenzione e il monitoraggio delle cartelle cliniche dei pazienti, del materiale biologico e delle estrazioni di campioni saranno gestiti da CITO.

La storia del paziente e del trattamento rivela che oltre alla chirurgia e alla chemioterapia, circa il 10% dei pazienti ha ricevuto Trastuzumab (terapia mirata ERBB2, chiamata anche Herceptin), un altro 10% ha ricevuto immunoterapia tra cui pembrolizumab e Ipilimumab (inibitori del checkpoint). Infine, circa il 5% dei pazienti ha ricevuto una terapia antiangiogenica (composta da una terapia mirata al VEGFR2 con Ramucirumab). Inoltre, l'analisi istologica ha mostrato che circa il 50% dei pazienti era classificato come tipo intestinale, il 30% come diffuso e il 20% misto o indeterminato.

Criterio di inclusione

• Maschio o femmina adulto, di età >18 anni
• Diagnosi di cancro gastrico (istologico o citologico)
• Frequentare i centri sanitari della rete Red UC Christus per almeno 3 mesi con follow-up clinico
• Capace di leggere e parlare spagnolo
• Disponibilità e capacità di fornire un consenso informato scritto allo studio che dovrebbe essere datato e firmato al momento dell'arruolamento.

Criteri di esclusione

Pazienti:

• Con piccoli campioni bioptici insufficienti per l'analisi.
• Le cui cartelle cliniche non possono essere raccolte o non sono disponibili.
• Senza consenso informato firmato.

Dati clinici I dati clinici dei pazienti saranno ottenuti dagli operatori sanitari e inseriti in una piattaforma elettronica online. I campioni saranno codificati e l'identità del paziente nota solo al medico curante. Le variabili cliniche sono suddivise in sezioni: Informazioni generali sul paziente, Storia del cancro, Studi di laboratorio, Indice di comorbidità (Charlson), Chemioterapia, Efficacia e follow-up e Tossicità. La chemioterapia del paziente sarà classificata per: regime, numero di cicli e tempo di trattamento e intensità della dose della chemioterapia durante i primi 6 mesi. Regimi chemioterapici che rappresentano la chemioterapia di prima linea prescritta ai pazienti. L'intensità completa della dose di chemioterapia durante i primi 6 mesi sarà ottenuta attraverso interviste ai pazienti e inserita direttamente nella piattaforma online. Infine, i dati di efficacia e follow-up e di tossicità ottenuti dai pazienti.

Principali risultati clinici I principali risultati saranno dedotti dai dati clinici ottenuti, questi includono la sopravvivenza globale, i tassi di sopravvivenza libera da progressione e senza recidiva.

Campioni biologici e Oncomine Comprehensive Assay I materiali biologici ottenuti presso il Red UC Christus saranno trasportati al CEMP di Santiago del Cile in base a protocolli standardizzati. Un totale di 200 campioni tumorali di pazienti sarà ottenuto da campioni archiviati in paraffina fissa in formalina (FFPE) archiviati. Gli acidi nucleici saranno estratti utilizzando il kit RecoverAll (Thermo Fisher Cat #AM1975) e analizzati utilizzando il kit Oncomine Comprehensive Assay disponibile in commercio. Questo test analizza simultaneamente DNA e RNA da campioni consentendo la valutazione di 73 hotspot genetici (basati sul DNA), 49 variazioni del numero di copie focali (CNV, basate sul DNA), 26 sequenze codificanti complete (per mutazioni e perdita di CNV) e 22 fusioni geniche driver (RNA). In particolare, 72 di questi geni sono bersagli farmacologici. Dati grezzi genomici ottenuti (.vcf e .pdf file) verranno archiviati e sottoposti a backup in un Data Center locale per la successiva analisi genomica. Dopo la pubblicazione dei risultati di questo studio, i risultati di Oncomine insieme alla classificazione clinica dei singoli tumori saranno resi pubblici.

Analisi Tissue Micro Array (TMA) I seguenti geni saranno ulteriormente analizzati da un TMA usando anticorpi specifici contro: PD-L1 (Dako, Cat # SK00521), PD-L2 (Thermo Cat# B7-DC/CD273), Phosphorylated mTOR ( Abcam Cat#AB118815), p53 (Cat # 5278074001), VEGFR2 (Abcam Cat #AB39256), Phosphorylated Akt (Thermo Cat #473), HER2 (Roche, Cat # 05278368001), p16 (Roche, Cat # 06695221001), Met ( Abcam Cat # AB51067), HA-4 (Abcam Cat # AB24480) e quattro marcatori microsatelliti (tutti di Roche): MLH1 (Cat # 06472966001), MSH2 (Cat # 05269270001), MSH6 (Cat # 5929911001), PMS2 (Cat # 06419216001). Il TMA manuale verrà preparato come descritto in precedenza. In breve, i blocchi di paraffina saranno ottenuti e tagliati e colorati con Hematoxylin & Eosin (H&E) al fine di selezionare la migliore area istologica. Successivamente l'area di tessuto selezionata verrà inserita nel TMA cerchiando l'area identificata nel blocco corrispondente. Le biopsie del nucleo cilindrico verranno estratte da ciascun blocco di paraffina utilizzando uno stiletto da 1 mm e posizionate in un nuovo blocco ricevente. I casi adeguati selezionati presentavano tumori che occupavano almeno il 10% dell'area centrale. Ogni caso verrà elaborato in triplice copia per prevenire la perdita di tessuto durante il taglio. Le sezioni di ciascun blocco di array di tessuti saranno tagliate, deparaffinate e disidratate per H&E e procedure immunoistochimiche.

Metilazione genica Verrà valutata la metilazione del gene promotore su sei geni selezionati che hanno precedentemente mostrato la regolazione del promotore mediante metilazione associata a GC. L'analisi della metilazione includerà il gene reprimo e altri mRNA associati alla progressione del GC. L'analisi sarà eseguita mediante bisolfito sequenziamento come descritto in precedenza utilizzando il kit EZ DNA methylation Gold (Zymo Research) con piccole modifiche. In breve, il DNA trattato con bisolfito viene amplificato utilizzando specifici primer PCR, con i prodotti PCR successivamente clonati e sequenziati.

Identificazione di EBV I sottotipi di EBV nei campioni dei pazienti saranno valutati utilizzando il metodo dell'ibridazione cromogenica in situ (CISH) con modifiche minori.

Analisi del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) Una percentuale significativa di pazienti con GC può sviluppare una grave tossicità dal trattamento con 5-FU, tra cui soppressione del midollo osseo, neuropatia, basso numero di globuli bianchi, febbre, infezioni, nausea, vomito, grave diarrea, bocca e apparato digerente infiammazione, che sono tutti registrati nella storia del paziente di altre coorti. Sottili cambiamenti personali e di popolazione nel DNA, chiamati SNP, possono spiegare l'aumento del rischio di tossicità del 5-FU; Il metabolismo del 5-FU è prevalentemente epatico, dove l'enzima DPYD è responsabile della metabolizzazione di >80% del farmaco, producendo il metabolita inattivo 5,6 diidrossi-5-FU. È ampiamente documentato che una ridotta attività del DPYP è associata a grave tossicità. La frazione non metabolizzata di 5-FU (20%) viene trasformata da una serie di enzimi (ad es. TP, TK), producendo i metaboliti attivi che causeranno l'inibizione di TYMS, promuovendo così il danno al DNA/RNA. Le variazioni nei geni TYMS e MTHFR (correlate alla ridotta sintesi di folati, all'aumento dell'effetto del 5-FU) sono state associate alla tossicità del trattamento con il 5-FU. L'approccio utilizzato per selezionare le varianti genetiche consisteva in una ricerca nel database PharmGKB. Saranno analizzati un totale di sei SNP non sinonimi: quattro di essi comprendono il gene DPYD, uno per TYMS e uno per MTHFR. L'analisi sarà eseguita utilizzando la tecnologia TaqMan™ SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems™). Gli SNP saranno valutati nel DNA isolato da campioni di pazienti inclusi in paraffina.

Dimensione del campione e analisi statistica

Il numero minimo di campioni sarà calcolato al fine di garantire il pieno raggiungimento degli obiettivi del progetto. Considerando che circa il 90% dei casi di GC sono effettivamente GAC, con un tasso di errore del 5% e un intervallo di confidenza del 95%, i ricercatori avevano inizialmente previsto una dimensione del campione di 200 pazienti. Tuttavia, i ricercatori hanno anche considerato un tasso del 15% di perdita del campione (campioni difettosi o abbandono del paziente), che ha dato un totale di 230 pazienti da reclutare.

La statistica descrittiva standard sarà utilizzata per analizzare variabili qualitative e quantitative, come frequenze relative e assolute, tabelle di frequenza, media, mediana, deviazione standard, intervallo e quartili. Una confidenza del 95% sarà considerata appropriata per l'analisi. Verranno inoltre utilizzate statistiche descrittive per caratterizzare i parametri clinici più rilevanti misurati. L'associazione delle variabili categorizzate sarà effettuata mediante test chi-quadrato o test esatto di Fisher. L'analisi della varianza a un braccio metterà a confronto le variabili continue tra i gruppi. Gli studi sui risultati di sopravvivenza saranno realizzati utilizzando il metodo Kaplan-Meier. I fattori prognostici saranno valutati secondo il modello di regressione dei rischi proporzionali di Cox.

Verrà condotta l'analisi delle componenti principali (PCA) delle varianti geniche e verrà valutata l'associazione delle prime componenti principali con un piccolo set predefinito di firme di alterazione genomica. Per definire i sottogruppi molecolari, i ricercatori utilizzeranno il clustering senza supervisione. La correlazione dei sottotipi molecolari con i dati clinici (ad es. età, sesso, classe di Lauren) ed esiti clinici (ad es. sopravvivenza globale, tasso di risposta) saranno valutati. Inoltre, la classificazione supervisionata sarà eseguita sulla base dei risultati clinici ei gruppi risultanti di entrambi gli approcci saranno confrontati con altri sottotipi molecolari riportati.

Tutela del paziente/moduli di consenso informato scritto

Tutte le parti garantiscono la protezione della cartella personale dei pazienti. I nominativi dei pazienti non sono inseriti in nessuna forma in schede-report, pubblicazioni, o in alcun tipo di documento pubblicabile derivato dallo studio ad eccezione dei documenti richiesti dalla legge. I moduli di consenso informato sono elaborati seguendo rigorosamente le normative legali e locali. I moduli di consenso informato scritto, comprese tutte le modifiche apportate durante lo studio, devono essere preventivamente approvati dall'Internal Review Board/comitato etico indipendente e dal CEMP prima di essere incorporati nello studio.

Gli sperimentatori, i rappresentanti o gli operatori sanitari otterranno moduli di consenso informato scritti da ogni paziente o da un rappresentante legale prima che venga eseguita qualsiasi attività specifica dello studio.