Diagnosztikai/prognosztikus biomarkerek keresése veseérintettségű SLE-ben proteomikai technikákkal (SLE)

HÁTTÉR ÉS STATUS QUO A TERÜLETEN

A szisztémás lupus erythematosus (SLE) egy szisztémás, krónikus autoimmun betegség, amely a kötőszövetet érinti, és a spanyol Ritka Betegségekért Alapítvány (FEDER) ritka betegségnek tekinti. Klinikai megnyilvánulásai változatosak, és a legtöbb szövet- és szervtípust érinthetik, különösen a bőrt, az ízületeket, a vérképző szerveket, a szívet, a tüdőt, a vesét és az idegrendszert (Galindo, 2008). Összetett betegség, változó klinikai lefolyású és prognózisú, váltakozó remissziós és exacerbációs periódusok (fellángolások) jellemzik. Emiatt fontos az egyes betegek prognózisának megállapítása, valamint a betegség aktivitására és a halmozott károsodásra vonatkozó mérések kidolgozása és validálása (Irastorza et al., 2012; Galindo, 2008; Cervera, 1993).

Az SLE etiológiája még mindig ismeretlen. Az autoantitestek változó termelése mellett genetikai és környezeti tényezők is szerepet játszhatnak a patogenezisében. Valószínű, hogy a különböző patogén és etiológiai ágensek részvétele magyarázza a betegségben szenvedő betegeknél megfigyelt biológiai és klinikai heterogenitást.

Az SLE előfordulása kortól, nemtől és etnikai csoporttól, valamint a vizsgált populáció egyéb jellemzőitől függően változik. Európában a legfrissebb adatok 1,5 eset/100 000 előfordulási gyakoriságot és 122 eset/100 000 prevalenciát mutatnak, míg Spanyolországban az EPISER tanulmány 9 eset/100 000 előfordulási gyakoriságot mutatott ki. A betegség köztudottan gyakoribb az afro-amerikaiak, spanyolajkúak és ázsiaiak körében, ráadásul ezekben a csoportokban súlyosabb, valószínűleg genetikai, gazdasági és kulturális tényezők keveredése miatt. A nő-férfi nemek aránya 10:1 körül van, bár a nőknél alacsonyabb a megbetegedések aránya a gyermekkorban vagy 65 éves kor után jelentkezők körében. A legtöbb betegnél az SLE jelei és tünetei 15 és 40 éves kor között alakulnak ki, a betegség kezdeti átlagos életkora 29 és 32 év között van (Galindo, 2008; Ruiz-Irastorza és mtsai, 2012).

Az SLE-s betegek 30-50%-ánál alakul ki vesebetegség, ami a betegek 10%-ánál ez az egyik első megnyilvánulás. A leggyakoribb klinikai megnyilvánulások közé tartozik a proteinuria, a mikrohaematuria, a húgyhólyag, a veseelégtelenség és a magas vérnyomás. Ez az állapot a diagnózis felállítása után 5-10 évvel a végstádiumú vesebetegség (ESRD) és a halálozás magasabb kockázatával jár (Galindo, 2008; Aran és mtsai, 2008; Ruiz-Irastorza et al., 2012; Sanz, 2014). .

A lupus nephritis (LN), az SLE gyakori szövődménye, a tünetmentes enyhe proteinuriától a veseelégtelenséggel járó, gyorsan progresszív glomerulonephritisig változhat. A glomerulus patológiás leletei, a WHO-osztályozás és annak frissítései alapján osztályozzák, a klinikai vizsgálatokban és a napi gyakorlatban egyaránt a legszélesebb körben alkalmazott. A WHO rendszere az LN hat különböző osztályát azonosítja, a III. és IV. osztályt, amelyek megfelelnek a betegség proliferatív formáinak. Ez a patológián alapuló, vesebiopszián alapuló osztályozás nagy jelentőséggel bír az ESRD-be való progresszió megelőzéséhez szükséges kezelés intenzitásának felmérésében (Silva-Fernández és mtsai, 2008; Sanz, 2014). Másrészt a vesebiopszia egy invazív orvosi eljárás, amely magasan képzett személyzetet igényel, és nem mentes a kockázatoktól és a szövődményektől. Jelenleg ez a teszt elengedhetetlen a végleges diagnózis felállításához, a károsodás súlyosságának felméréséhez ("stádiumbesorolás") és a legjobb kezelés kiválasztásához (Carpio, 2003; Ruiz-Irastorza et al., 2012).

Sőt, mire a betegeket diagnosztizálják, már a betegség előrehaladott stádiumában lehetnek, ami megnehezíti a kezelést és a kezelést. Emiatt a gyors kezelést lehetővé tevő módszerek annak felmérésére, hogy az egyéneknél fennáll-e ennek az állapotnak a kialakulásának kockázata a korábbi szakaszban, növelnék a kezelések sikerességének valószínűségét, és ezáltal a betegek életminőségét.

A proteomika kulcsfontosságú eszközöket biztosít az adatok megszerzéséhez a diagnózis és/vagy a prognózis javítása érdekében, és mint ilyen, a transzlációs kutatások egyik alapja. A proteom egy dinamikus entitás, amely folyamatosan változik a sejteket érintő folyamatok hatására, mint például a stressz, a betegségek és az orvosi kezelések. A fehérje- és/vagy peptidexpresszió különbségeinek elemzése egészséges egyénekből és egy adott betegségben szenvedő betegekből származó mintákban nagyon értékes információkkal szolgál a betegség molekuláris és fiziológiai alapjairól (Pando és Ferreira, 2007; Ali et al., 2005; Arrollo, 2005).

A biomarkerek olyan in vivo biológiai folyamatokhoz kapcsolódó molekulák, amelyek jelentősen változnak a fiziológiai körülményektől függően. Használhatók a klinikai gyakorlatban szűrésre, diagnózis felállítására, betegségaktivitás monitorozására, adott kezeléssel prognózis becslésére vagy a betegség kiújulásának kimutatására. Ezzel kapcsolatban a szilárd fázisú extrakción (SPE) alapuló proteomikai analízis a mátrix-asszisztált lézeres deszorpciós/ionizációs (MALDI)-repülési idő (TOF) profilozással kombinálva lehetővé teszi a peptidek és kisméretű fehérjék olcsó és gyors szűrését. biológiai folyadékok. Esetünkben az elemzendő folyadék vizelet lenne, és ez lehetővé tenné, hogy a mintavétel non-invazív legyen, elkerülve a biopsziával kapcsolatos kockázatokat.

A vizelet valószínűleg a legjobb testfolyadék a vesebetegség biomarkereinek megszerzéséhez, két okból is: 1. A vese termeli, ezért bármely azonosított biomarker közvetlenül tükrözheti a veseműködést (Tianfu W. et al., 2013). 2. A minták könnyen és non-invazív módon szerezhetők be

Az LN értékelésére SPE-vel és lézeres deszorpciós/ionizációs-TOF tömegspektrometriával kombinálva Suzuki és munkatársai publikáltak tanulmányokat. (2007) a gyermekkori nephritisről, valamint Mosley et al. (2006), vizeletprofilok használatát vizsgálja az aktív és inaktív betegségben szenvedő betegek megkülönböztetésére. Mindkét csoport felületnövelt lézeres deszorpciós/ionizációs technikákat használt, amelyeket főként az SPE vált fel MALDI-TOF tömegspektrometriával kombinálva (Callensen, Proteomics áttekintés), amely nagyobb felbontóképességgel rendelkezik, pontosabb tömegméréseket tesz lehetővé és jobb. érzékeny. Ezzel kapcsolatban számos tanulmányt végeztek, köztük Gonzáles és mtsai. (2012) könnyezve, különbséget tenni az egyének között; Iloro et al. (2013) vizeletben, egy gyógyszer toxicitásának nyomon követésére. A MALDI-TOF tömegspektrometria kombinációja az SPE technikák szelektív képességével, például fordított fázisú gyantákat (C18) és/vagy ioncserét (gyenge kation- vagy anioncserét) alkalmazva jobb eredmények elérését tenné lehetővé, mint a a fent említett tanulmányokat. Az ilyen típusú profilalkotási elemzések egyik erőssége, hogy gyors és olcsó, hanem egy biomarker-panel intenzitására épül.

Ebben az értelemben több csoport leírt néhány proteomikus biomarkert, amelyek potenciálisan összefüggésbe hozhatók az LN-re való érzékenységgel és a mögöttes patogenezissel (Li és mtsai, 2013; Wu és mtsai, 2013; Masanori et al., 2013; Zhu X et al., 2012; Nakatani et al., 2012). Már vannak olyan tanulmányok, amelyek hozzájárultak az egészségügyhöz, például a proteomikai vizsgálatok vesebiopsziákban való alkalmazása, amelyek segítettek a membranoproliferatív glomerulonephritis (MPGN) átsorolásában (Caster és mtsai, 2015; Stoskar et al., 2012). Alaiya és munkatársa (2014) proteomikus vesebiopsziával végzett vizsgálatot, amelyben megállapították, hogy nincs erős bizonyíték a IV. osztályú lupus nephritis két alkategóriájának megkülönböztetésére. Bruschi és munkatársai (2014) tipikus proteomikai antitesteket figyeltek meg a vese NL-ben, amelyek a szérumban is megtalálhatók. Yajuan Li és mtsai (2013); Tianfu és munkatársai (2013); Masanori H. et al, (2013); Xuejing Zhu et al, (2012); Nakatani és munkatársai (2012) leírják az NL-re való érzékenységgel és patogenezissel kapcsolatos lehetséges proteomikus biomarkereket. Ezek a tanulmányok bebizonyítják, hogy mind a klinikusok, mind a tudósok információval szolgálhatnak a patológia prognózisában és diagnosztizálásában a kezelések javításában, valamint az etiológiával, patogenezissel és a betegség aktivitásával kapcsolatosan (Caster et al., 2015).

Egy első kísérleti vizsgálatban, amelyet OSI BILBAO BASURTO-ban szenvedő, SLE-vel diagnosztizált NL-vel és anélkül diagnosztizált betegeken végeztek, az ANOVA (162 protein p) elemzésével differenciált fehérjemintázatot figyeltek meg a két betegcsoport, valamint az enyhe és jelentős veseelégtelenségben szenvedő betegek között is. <0,01) (Rivera et al., 2018).

Ebben az összefüggésben, és a betegségek molekuláris és fiziológiai alapjainak elmélyítése érdekében, arra törekszik, hogy különbséget tegyen az SLE-vel diagnosztizált, autoimmun nefropátia nélküli NL-betegek és egészséges donorok populációi között. A használt minta a 24 órás vizelet. A biológiai minták megszerzése és feldolgozása után a MALDI TOF SPE az Autoflex III-ban (bioGUNE) elemzi azokat.

MÓDSZERTAN

Ebben a kutatási projektben eset- és kontrollvizsgálat elvégzését javasoljuk. Ehhez először gondosan osztályozzuk a vizsgálati csoportokat a betegekre vonatkozó klinikai adatok felhasználásával. A Basurto Egyetemi Kórház Reumatológiai Osztálya elsősorban az SLE-vel foglalkozó autoimmun betegségekben ad szaktanácsadást, ezekből származnak majd az SLE-s és LN-es betegek többsége és az összehasonlító csoportok, valamint az egészséges vagy diagnosztizált mintaadók. nem immunbetegségek. A nem autoimmun lupus nephritissel diagnosztizált betegeket a kórház nefrológiai osztálya veszi fel.

Az adatok statisztikai elemzése

Először a változók leíró elemzését végezzük el, és felmérjük, hogy kapcsolódnak-e az LN-hez.

Másodszor, meghatározzuk, hogy a tesztelt biomarkerek jelen vannak-e a vizsgálati és összehasonlító populációkban, majd felmérjük, hogy vannak-e szignifikáns különbségek a vizsgálati és összehasonlító csoportok között az egyes jelölt markerek esetében. A továbbiakban többváltozós elemzést végzünk, és ehhez a profilalkotási vizsgálatokban megszokott módon főkomponens elemzést alkalmazunk. Rutinszerűen kiszámítjuk a vevő működési jelleggörbéit, mivel ezek lehetővé teszik számunkra, hogy a biomarkerként potenciális peptideknek megfelelő tömegeket válasszuk ki. Végül osztályozási algoritmusokat (genetikus algoritmusokat és/vagy felügyelt neurális hálózatokat) használunk olyan tömeghalmazok kiválasztására, amelyek lehetővé teszik a populációcsoportok megkülönböztetését, és statisztikai osztályozókat generálunk a modell megbízhatósági szintjének felmérésére és az azt követő érvényesítésre ( Celesen et al., 2009).

A tanulmány korlátai:

A fehérjék nagyon labilisak, és hajlamosak a fizikai tényezők, többek között a műanyagokkal való érintkezés hatására megváltozni. Emiatt a használandó műanyag 24 órás vizeletgyűjtő edényekkel kapcsolatos adatok lehetséges zajának csökkentése érdekében a résztvevőket ugyanabból a tételből kapják meg. Az összes mintát a Basurto Kórház kutatóirodájába kell leadni, egységesítve a minták kezelésének módját. Ezenkívül protein LoBind csöveket, lemezeket stb. fogunk használni, hogy minimalizáljuk a fehérjék kötődését a műanyaghoz.

Etikai megfontolások.

A tanulmányt a Helsinki Nyilatkozat elveivel összhangban végezzük. A Nyilatkozat és módosításai másolatai kérésre rendelkezésre állnak, vagy megtalálhatók az Orvosi Világszövetség honlapján a http://wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html címen.

A vizsgálatot a protokoll és a szabványos működési eljárások szerint kell elvégezni, és ez biztosítja a helyes gyakorlati iránymutatások betartását, amint azt az 1996-os háromoldalú harmonizált nemzetközi konferencia a helyes klinikai gyakorlat harmonizációs iránymutatásaiban leírták.