Cellule staminali mesenchimali autologhe del midollo osseo alveolare per la ricostruzione di difetti parodontali infraossei (PerioRegen)

Scopi e obiettivi Il presente studio descrive un nuovo metodo per rigenerare i tessuti parodontali nei difetti infraossei parodontali utilizzando BM-MSC autologhe, prive di reagenti di origine animale, prodotte in camere bianche arricchite con colla di fibrina autologa e seminate in scaffold di collagene disponibili in commercio (vello di collagene ).

Obiettivo primario Questo studio mira a valutare l'efficacia di un nuovo trattamento rigenerativo dei difetti infraossei parodontali utilizzando un biocomplesso di BM-MSC/colla di fibrina/vello di collagene, rispetto a un sostituto dell'innesto privo di cellule di colla di fibrina/vello di collagene e a un controllare l'approccio terapeutico dello sbrigliamento a lembo aperto senza l'uso aggiuntivo di materiali di innesto.

Obiettivi secondari

• Documentare la stabilità del risultato del trattamento migliorato e continuare a valutare la sicurezza e l'efficacia del trapianto di BM-MSC rispetto al trattamento di controllo del debridement a lembo aperto durante il periodo di studio.
• Determinare i profili immunologici e microbiologici dei partecipanti durante tutto il periodo di studio nel tentativo di comprendere gli effetti locali e sistemici del trapianto di BM-MSC in siti con malattie croniche, come il difetto parodontale infraosseo. Inoltre, la risposta di guarigione al trattamento sarà determinata durante tutto il periodo di osservazione (dal basale a 12 mesi).

Progettazione dello studio

Prodotti sperimentali Le colture di aBM-MSC saranno stabilite da biopsie ossee derivate dal midollo osseo dell'osso alveolare in ciascun paziente appartenente al gruppo A. In breve, dopo un accurato risciacquo orale con clorexidina 0,12% per 1 minuto, verrà eseguita un'osteotomia utilizzando un trapano a trapano. eseguita nell'osso alveolare e verrà prelevato un nucleo osseo di 2x8 mm. L'area verrà irrigata con soluzione salina e quindi i lembi verranno suturati per ottenere la chiusura primaria nel sito donatore. Il campione osseo verrà quindi immediatamente inserito in provette sterili contenenti HBSS e antibiotici/antimicotici e sarà trasportato presso una struttura autorizzata conforme alle buone pratiche di laboratorio (BPL) che soddisfa le linee guida di qualità stabilite dall'Unione Europea per la preparazione di steli di grado clinico colture cellulari per la consegna al paziente. L'isolamento di aBM-MSC sarà eseguito utilizzando il metodo della dissociazione enzimatica, come precedentemente descritto (Bakopoulou 2013). Per l'espansione della coltura, il siero autologo ottenuto da 60 ml di sangue venoso raccolto da ciascun soggetto verrà utilizzato per integrare il terreno di coltura cellulare aMEM, al fine di evitare l'uso di reagenti di origine animale, come il siero bovino. La biopsia ossea verrà immediatamente elaborata per garantire un'elevata vitalità delle colture stabilite. Dopo l'espansione per due passaggi (tempo approssimativo necessario 16-24 giorni a seconda del donatore di cellule) le cellule saranno raccolte per la consegna al paziente. Per la dissociazione cellulare e il passaggio, verranno utilizzati enzimi ricombinanti altamente purificati e compatibili GMP (Tryple, Thermo Fisher Scientific) per evitare l'uso di tripsina porcina. A questo punto, sarà necessario un campione di 20 ml di sangue venoso per la preparazione della colla di fibrina autologa nel gruppo B, poiché nel gruppo A il salasso iniziale (60 ml) coprirà le esigenze delle colture cellulari e la preparazione della colla di fibrina. Successivamente, la colla di fibrina verrà caricata con cellule staminali (Gruppo A) o senza (Gruppo B) in uno scaffold in pile di collagene disponibile in commercio direttamente prima dell'applicazione clinica.

Controllo di qualità delle colture BM-MSC stabilite prima dell'applicazione clinica

Prima della consegna al paziente, tutte le colture di BM-MSC saranno valutate per:

• Fattibilità utilizzando l'esclusione Trypan Blue
• Sterilità: le colture saranno testate per potenziali contaminazioni da batteri, micoplasmi ed endotossine (test LAL)
• Proprietà di "staminalità" basate sui criteri minimi stabiliti dalla International Society for Cellular Therapy (ISCT) per quanto riguarda le MSC (Dominici et al 2006).

Nota: la metodologia sui metodi di caratterizzazione delle cellule staminali è descritta analiticamente in precedenti pubblicazioni del nostro gruppo di ricerca (Bakopoulou et al. 2013).

Dopo l'applicazione della miscela BM-MSCs/colla di fibrina/CaCl2 negli scaffold di collagene, un piccolo campione del biocomplesso di casi selezionati casualmente sarà separato usando forbici chirurgiche e sarà trasferito al laboratorio per ulteriore (in parallelo all'applicazione clinica ) caratterizzazione ex vivo del comportamento delle cellule staminali in un microambiente biomimetico. Ciò consentirà la correlazione tra il comportamento delle cellule staminali e l'esito clinico, poiché il recupero e l'analisi dei tessuti rigenerati direttamente dall'ospite non è fattibile per motivi etici.

Preparazione della colla di fibrina autologa Saranno raccolti 20 ml di sangue venoso dalla fossa antecubitale dei pazienti dei gruppi A e B e i campioni di sangue verranno immediatamente trasferiti in una provetta di falco, che contiene anticoagulante. Dopo la determinazione della conta piastrinica, il campione di sangue sarà centrifugato (2000rpm, 10min) e il plasma sarà separato e conservato in un altro falco. Verrà quindi determinata la conta piastrinica e il campione sarà nuovamente centrifugato. Il PRP (plasma ricco di piastrine contenente 1.000.000 plts/ul) sarà quindi separato dal supernatante PPP (plasma povero di piastrine) ed entrambe le preparazioni saranno ulteriormente processate seguendo un protocollo standard per la preparazione della colla di fibrina (Biohellenika, Salonicco, Grecia).

Disegno del braccio clinico dello studio

Preselezione dei soggetti I soggetti verranno reclutati tra i nuovi referenti del Dipartimento di Odontoiatria preventiva, Parodontologia e Biologia implantare; non verrà intrapresa alcuna pubblicità esterna o reclutamento. I soggetti saranno in buona salute generale.

Ammissione allo studio Prima dell'ammissione allo studio, ogni soggetto sarà informato dal ricercatore principale della natura e dei rischi dello studio sia oralmente che per iscritto (Modulo di informazione del soggetto) e il consenso informato scritto (Modulo di firma del consenso informato del soggetto) sarà ottenuto. Ad ogni soggetto verrà consegnata una copia del proprio modulo di consenso debitamente firmato da conservare per i propri archivi. Saranno registrati i dati demografici personali e la storia medica dei soggetti e l'idoneità allo studio in conformità con i criteri di inclusione ed esclusione stabiliti nel protocollo. I soggetti possono continuare qualsiasi farmaco non incluso nei criteri di esclusione; tuttavia, questi farmaci devono essere documentati insieme a qualsiasi condizione medica concomitante non preesclusa.

Procedure per il ritiro o l'interruzione del soggetto Qualsiasi soggetto che desideri ritirarsi dallo studio per motivi personali o per qualsiasi altro motivo, ha il diritto di farlo. Tuttavia, il motivo del ritiro di qualsiasi soggetto dallo studio oltre al fatto che il motivo sia correlato al prodotto in esame sarà registrato dal ricercatore principale. Qualsiasi partecipante che non si presenti più di due volte viene rimosso dallo studio. I soggetti che manifestano un evento avverso saranno esclusi dall'ulteriore partecipazione allo studio.

Se un soggetto desidera ritirarsi dallo studio, verranno compiuti tutti gli sforzi per completare e riportare le osservazioni nel modo più completo possibile fino alla data del ritiro. Ai soggetti verrà chiesto di prendere in considerazione la possibilità di fornire ulteriori informazioni sui motivi del ritiro. Qualsiasi informazione riportata verrà registrata.

Durata prevista della partecipazione di ciascun soggetto Si prevede che ciascun soggetto partecipi a nove visite in totale per un periodo di 12 mesi; una visita di screening, una visita di trattamento per ricevere il trattamento chirurgico dell'area designata, quattro revisioni di follow-up e tre visite aggiuntive per la rivalutazione clinica e radiografica e la raccolta di campioni (saliva intera, liquido crevicolare gengivale (GCF), placca sottogengivale).

Calibrazione e randomizzazione degli investigatori I pazienti saranno selezionati per l'idoneità da un esaminatore e saranno arruolati uno alla volta su base continua dopo aver ottenuto un numero di codice. Un collaboratore dello studio non coinvolto nella raccolta dei dati eseguirà la randomizzazione e annuncerà la modalità di trattamento al terapeuta tramite comunicazione telefonica. Le valutazioni cliniche saranno effettuate da un unico esaminatore che non avrà accesso alle registrazioni precedenti e non sarà altrimenti coinvolto in altre procedure cliniche. Verrà eseguito un esercizio di calibrazione dello sperimentatore per ottenere una riproducibilità intra-esaminatore accettabile per PPD, CAL e valutazione dell'anatomia del difetto. La riproducibilità intra-esaminatore sarà valutata dal coefficiente di correlazione intraclasse (ICC) e dai limiti di concordanza del 95% di Bland-Altman (Bland e Altman, 1999).

Analisi statistica dei dati sperimentali L'analisi sarà effettuata utilizzando il software IBM Statistics SPSS 20.0. I dati saranno espressi come media +/- deviazione standard (DS). Gli squilibri tra il test ei gruppi di controllo generati dalle procedure di randomizzazione saranno valutati utilizzando il test t per campioni indipendenti per le variabili continue e il test esatto di Fisher o il test del chi quadrato per le variabili categoriali. La significatività degli effetti del trattamento sulle variabili dipendenti modifiche CAL, modifiche PPD e modifiche radiografiche sarà stimata costruendo modelli misti lineari utilizzando la procedura SPSS MIXED. Per tutte le analisi la significatività statistica sarà fissata a p<0.05.

Considerazioni etiche / Autorizzazioni per colture di cellule staminali Biohellenika, Salonicco, Grecia fornisce strutture e laboratori all'avanguardia che operano secondo le normative più severe per la lavorazione e la conservazione delle cellule staminali. I laboratori sono autorizzati secondo l'ordinanza governativa 26/24-3-2008 (regolamento della legge greca secondo la legge europea 2004/23/K del e Consiglio 31-3-2004 per la creazione di prototipi di qualità e sicurezza per la donazione, il acquisto, i controlli di qualità sulla crioconservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di tessuti e cellule umani (EEL 102/7-4-2004) e le relative linee guida 2006/17 EK (EEL 38/9/2006) e 2006/86EK (EEL 294 /25-10-2006). La licenza F 6172/17514/1269 è pubblicata sul GdR 2589 del 31/12/2009.

Da novembre 2014, Biohellenika opera ai sensi della nuova legge 3984, pubblicata nel documento Gov n. 150, 2011 dopo una raccomandazione positiva del Comitato Nazionale Trapianti al Dipartimento della Salute e al momento la nuova licenza sta per essere pubblicata nel documento Gov.

I laboratori e le procedure sono accreditati dall'Associazione Americana delle Banche del Sangue (AABB), ultima ispezione 30 settembre 2014 e dal Sistema Nazionale di Accreditamento secondo ISO 15189:2007. Anche i laboratori sono certificati secondo ISO 9001:2008, per la lavorazione, controllo qualità e crioconservazione di linee cellulari autologhe e ISO 13485:2003 per il sistema di crioconservazione che è anche un brevetto internazionale di Biohellenika.

Le camere bianche operano secondo le linee guida di BSR Ingenieur-Buro con ISO 14644-5. I livelli di sicurezza soddisfano tutti gli standard ISO 27001 e l'azienda è autorizzata e regolamentata dal Garante per la protezione dei dati personali.

I laboratori sono monitorati 24 ore su 24 per la qualità dell'aria e dotati di sistema di database Cryo-View, sistema di codici a barre ISBT 128, livello di temperatura-liquido N2, allarmi di sicurezza e due generatori di corrente.

Programma di studio Progettazione clinica e interventi per il trapianto autologo di BM-MSC I soggetti con grave parodontite cronica riceveranno un trattamento parodontale non chirurgico in anestesia locale utilizzando strumenti manuali e elettrici, oltre alla motivazione nella cura parodontale e istruzioni complete sull'igiene orale . I soggetti saranno rivalutati clinicamente sei settimane dopo il completamento del trattamento non chirurgico e quei soggetti con tasche parodontali rimanenti (PPD e CAL ≥ 6 mm; componente infraossea ≥ 3 mm) e nessun segno evidente di infiammazione gengivale sarà sottoposto a screening per l'idoneità a partecipare al studio attuale. La visita di screening includerà un esame parodontale iniziale dell'intera bocca, un esame radiografico intraorale e il rispetto dei criteri di inclusione/esclusione. In caso di idoneità, la natura dello studio sarà spiegata in dettaglio a tutti i soggetti e un modulo di consenso firmato approvato dal Comitato Etico della Dental School, AUTh. sarà ottenuto da ciascun partecipante. Quindi, i pazienti verranno assegnati in modo casuale in uno dei tre gruppi di trattamento (-A, -B e -C). In ogni paziente verrà trattato un singolo difetto.

Successivamente, verrà prelevata una biopsia ossea e campioni di sangue dai partecipanti del gruppo A in condizioni rigorose di sterilità. Ogni campione verrà quindi immediatamente inserito in provette sterili e sarà trasportato a Biohellenika, Salonicco, Grecia (http://www.biohellenika.gr) per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali secondo un protocollo rigoroso (Bakopoulou et al. 2013, Bakopoulou et al. in preparazione). Poiché le MSC saranno isolate ed espanse in vitro in camere bianche di classe GLP che soddisfano le linee guida di qualità stabilite dall'Unione Europea e nessun reagente derivato da animali sarà utilizzato durante gli esperimenti per il trapianto autologo, le cellule sono considerate sicure per le applicazioni di terapia cellulare clinica umana . Nelle strutture Biohellenika verranno raccolti 60 ml di sangue venoso da ciascun soggetto del gruppo A poco dopo il prelievo della biopsia, in modo che il siero autologo venga utilizzato per l'isolamento e l'espansione della coltura delle cellule staminali autologhe. Inoltre, verrà utilizzata colla di fibrina autologa per caricare le BM-MSC sul tessuto di collagene. Inoltre, verrà prelevato un campione di sangue di 20 ml da soggetti del gruppo B, al fine di fornire colla di fibrina che arricchirà il vello di collagene prima dell'inserimento chirurgico nel difetto osseo. Infine, i soggetti del gruppo C non saranno chiamati per il salasso poiché i difetti infraossei in questi individui saranno gestiti chirurgicamente mediante sbrigliamento del lembo aperto senza l'uso aggiuntivo di materiali di innesto.

Nell'ambito del controllo di qualità GLP, le MSC saranno analizzate per la sterilità e le endotossine e saranno anche testate per la potenziale contaminazione da batteri (BD BACTEC™), micoplasma ed endotossine (test LAL).

L'anestesia locale (1,8 ml di lidocaina al 2% con epinefrina 1:80.000; Lignospan special, Septodont) sarà infiltrata negli aspetti buccali e linguali dei denti coinvolti evitando le papille. Successivamente, verranno eseguite incisioni strettamente intrasolculari per preservare i tessuti gengivali ed in particolare la papilla interdentale associata al difetto osseo-dentale (Cortellini, 2012; Cortellini e Tonetti 2007). Il difetto verrà sbrigliato e la radice accuratamente levigata con l'uso combinato di curette di Gracey e strumenti motorizzati (EMS Piezon®, EMS, Nyon, Svizzera). Si avrà cura di conservare la parete dei tessuti molli dei difetti e il difetto osseo sarà irrigato con soluzione salina per controllare il sanguinamento.

Nel Gruppo A, il materiale di innesto (BM-MSCs arricchito con colla di fibrina) verrà somministrato in due siringhe da insulina contenenti ciascuna 5x10E6 cellule/100μl di fibrina e verrà caricato delicatamente sul tessuto di collagene e polimerizzato con l'aggiunta di CaCl2. Successivamente, il biocomplesso verrà delicatamente inserito nel difetto fino al completo riempimento. La manipolazione dell'impalcatura viene eseguita con cura per evitare qualsiasi distruzione di cellule vitali.

Nel gruppo B, il vello di collagene arricchito con colla di fibrina privo di cellule vitali riempirà con cautela il difetto osseo verticale. Nei gruppi -A e -B la somministrazione della colla di fibrina con/senza cellule vitali sarà identica, in modo che il terapista non veda le procedure.

Gruppo C, i pazienti riceveranno lo sbrigliamento del lembo aperto e la levigatura radicolare della superficie radicolare in modo simile ai soggetti dei gruppi -A e -B, ma non ci sarà l'uso aggiuntivo di materiali di innesto.

L'operatore sarà all'oscuro della modalità di trattamento (Gruppi -A e -B), mentre nel Gruppo C poiché non verranno utilizzati materiali di innesto, la modalità di trattamento diventerà ovvia per l'operatore ma ciò avverrà verso la conclusione dell'intervento , dopo la raccolta dei dati clinici. In tutti i gruppi si cercheranno tecniche di preservazione della papilla e tecniche chirurgiche minimamente invasive, evitando di segnare il periostio. I lembi saranno riposizionati e suturati usando una singola sutura a materassaio interna modificata (5-0 Monosyn, Braun) nell'area interdentale associata al difetto e suture simili saranno impiegate per chiudere i lembi in qualsiasi altra area interdentale. Due settimane dopo l'intervento chirurgico verrà eseguita l'osservazione clinica per la guarigione senza problemi o la presenza di reazione tissutale avversa seguita dalla rimozione della sutura.

Serie di casi per l'ingegneria tissutale In una serie di casi (cinque) con inclusione/criteri simili a quelli sopra ma senza passare attraverso la randomizzazione, l'ingegneria tissutale viene applicata seguendo la stessa metodologia del gruppo A. In questi casi, il costrutto di ingegneria tissutale (biocomplesso) è applicato per il trattamento di difetti parodontali interdentali isolati utilizzando una tecnica chirurgica di nuova concezione la cosiddetta "tecnica chirurgica chiusa". In sintesi, questa tecnica prevede la retrazione dei lembi gengivali in maniera chiusa senza sezionare i tessuti molli o la papilla interdentale. Questa tecnica riduce al minimo il trauma tissutale, il disagio postoperatorio e migliora l'estetica dei tessuti molli.

Cure postoperatorie Il dolore postoperatorio sarà controllato con ibuprofene (600 mg) alla fine della procedura chirurgica e 12 ore dopo in caso di dolore. Amoxicillina (500 mg / 8 ore per cinque giorni) sarà prescritta a tutti i partecipanti. Tutti i pazienti verranno istruiti a utilizzare la clorexidina allo 0,12% due volte al giorno ed evitare di spazzolare, usare il filo interdentale e masticare forte nell'area trattata per quattro settimane. Durante questo periodo di 4 settimane, verrà istituito un rigoroso programma di assistenza postoperatoria di supporto a intervalli bisettimanali, dopodiché i pazienti interromperanno il risciacquo con soluzione di clorexidina e riprenderanno l'igiene orale. La pulizia interdentale inizierà sei settimane dopo l'intervento per tutti i gruppi. Successivamente, i soggetti saranno visti a tre, sei e 12 mesi per cure di supporto parodontali.

Registrazioni cliniche Registrazioni parodontali full-mouth e sito-specifiche incluso BOP; Indice di placca (presenza/assenza di placca); PPD e CAL saranno determinati utilizzando una sonda parodontale manuale (Hu-Friedy XP-23/QW) al millimetro più vicino in sei siti per dente e parallela all'asse lungo in quattro punti temporali; basale, 6, 9, 12 mesi. Le misurazioni cliniche nei siti designati (difetti infraossei) saranno determinate prima dell'intervento chirurgico e prima dell'anestesia (basale). Le valutazioni intra-chirurgiche saranno effettuate una volta durante l'intervento chirurgico.

Valutazioni cliniche intra-chirurgiche La morfologia del difetto (una, due, tre pareti o combinazione) sarà determinata intra-chirurgicamente dal numero di pareti ossee associate alla lesione; La distanza tra la giunzione smalto-cementizia e il fondo del difetto (CEJ-BD) sarà determinata in mm; La distanza dalla CEJ al livello interprossimale più coronale della cresta ossea (CEJ-BC) sarà determinata in mm; La profondità totale del difetto: la distanza tra la cresta ossea e il fondo del difetto (BC-BD) sarà determinata in mm; La larghezza della larghezza del difetto (distanza orizzontale tra la cresta ossea e la superficie della radice) sarà determinata in mm.

Se la CEJ non è rilevabile a causa di un restauro cervicale, il margine del restauro (RM) fungerà da punto di riferimento per le misurazioni cliniche e radiografiche.

Valutazione radiografica Verrà utilizzata la radiografia digitale intraorale per determinare la rigenerazione ossea dei difetti infraossei in sei punti temporali; basale, 6 settimane, 3, 6, 9, 12 mesi. Le radiografie digitali periapicali standardizzate (RadioVisioGraphy; Trophy Radiology S.A., Parigi, Francia) saranno ottenute utilizzando la tecnica del parallelismo a cono lungo. Per standardizzare la geometria dell'esposizione, un morso personalizzato di un materiale da impronta elastico verrà regolato sul supporto del sensore, conservato in contenitori di plastica sigillati a temperatura ambiente e sarà riutilizzato durante ogni appuntamento radiografico di richiamo.

Analogamente alla valutazione intrachirurgica, sulle radiografie verranno definiti i seguenti punti di repere anatomici: la giunzione amelocementizia (CEJ), il livello più coronale dell'osso alveolare (BC) e l'estensione apicale della perdita ossea ( BD). Più in dettaglio, sarà individuata la sede della CEJ; l'area più coronale in cui il legamento parodontale mantiene una larghezza uniforme sarà identificata sulla radiografia per indicare l'estensione più apicale della perdita ossea. Il difetto infraosseo sarà calcolato misurando la larghezza del difetto all'aspetto più coronale e alla base; la distanza tra CEJ-BD e BC-BD; la distanza tra CEJ-BC; l'angolo tra l'asse verticale della radice e la parete ossea interdentale (Tonetti et al. 1993). La valutazione radiografica della rigenerazione ossea sarà definita su un monitor ad alta definizione dallo stesso esaminatore calibrato che è cieco alla modalità di trattamento e non ha accesso alle registrazioni precedenti. Le valutazioni saranno effettuate utilizzando lo strumento di misura per misure numeriche (software VixWin™ Platinum|Gendex) con riferimento ad una barra metallica di lunghezza standard (5mm) che verrà fissata al sensore.

Raccolta dei campioni I campioni saranno raccolti nel seguente ordine in sei punti temporali; basale, 6 settimane, 3, 6, 9, 12 mesi.

(i) Saliva La saliva verrà raccolta prima delle misurazioni parodontali cliniche o di qualsiasi intervento parodontale e generalmente al mattino dopo un digiuno notturno durante il quale i soggetti sono invitati a non bere (eccetto acqua) o masticare gomme. I campioni di saliva intera saranno ottenuti espettorando in tubi di polipropilene da 30 ml per 5 minuti.

(ii) GCF Campioni di fluido crevicolare gengivale saranno ottenuti dagli aspetti buccali interdentali dei difetti. Prima della raccolta del GCF, le superfici saranno asciugate delicatamente all'aria e isolate dalla saliva posizionando rotoli di cotone e utilizzando un aspirasaliva. Quindi, la placca sopragengivale verrà accuratamente rimossa con curette sterili e strisce di carta (Periopaper, OraFlow Inc., Smithtown, NY, USA) verranno posizionate nella tasca parodontale fino a quando non si avverte una leggera resistenza per 30 secondi. Sarà prestata attenzione per evitare traumi meccanici durante il posizionamento delle strisce e quelle contaminate con sangue verranno scartate. Ogni striscia per paziente verrà conservata in una provetta per microcentrifuga separata da 1,5 ml e conservata a -70°C. Prima dell'uso, le proteine ​​sulle strisce verranno eluite in 500 µl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) addizionata di BSA (1% v/v).

(iii) Placca Dopo la raccolta GCF, la placca subgengivale verrà prelevata dal sito designato. L'area di campionamento sarà isolata dalla saliva, asciugata delicatamente con aria, e dopo essersi assicurati che non siano presenti depositi di placca sopragengivale, due punte di carta verranno posizionate per 30 secondi nella tasca parodontale e verrà raccolto un campione raggruppato. Tutti i campioni saranno conservati in provette Eppendorf (Eppendorf, Amburgo, Germania) a -80°C prima dell'elaborazione. I punti di carta saranno utilizzati per la raccolta della placca microbica al fine di evitare disturbi meccanici dei tessuti parodontali.

Gestione dei dati Gli investigatori devono garantire il mantenimento dell'anonimato del soggetto. Su qualsiasi documentazione correlata allo studio, i soggetti devono essere identificabili solo tramite le loro iniziali, il sesso e/o il numero del soggetto. Informazioni personali (es. tessere mediche) saranno conservate in un luogo separato e sicuro, lontano da altri dati specifici dello studio con accesso limitato solo al ricercatore principale.

Processo di consenso informato È responsabilità del ricercatore principale ottenere il consenso scritto dal soggetto. Il modulo di consenso informato sarà composto da due documenti separati; un modulo di informazioni sul soggetto e un modulo di firma del consenso informato del soggetto; entrambi i documenti saranno approvati dal comitato etico della Dental School, AUTh prima dello studio. Il modulo informativo sul soggetto fornirà un'adeguata spiegazione, in un linguaggio nativo non tecnico comprensibile al soggetto, degli scopi, degli obiettivi, dei metodi, dei benefici previsti e dei potenziali rischi dello studio. Il ricercatore principale deve quindi fornire al soggetto ampio tempo per leggere e comprendere il modulo di consenso informato e per prendere in considerazione la partecipazione all'indagine clinica. Il ricercatore principale e il soggetto devono firmare e datare il modulo prima che il soggetto possa partecipare all'indagine clinica. Ad ogni soggetto verrà quindi rilasciata una copia del modulo di consenso informato debitamente firmato e datato e qualsiasi altra informazione scritta.