Microbiota intorno ai denti e agli impianti parodontali affetti da malattia perimplantare.

Prelevato tramite punti di carta sterili, per uso endodontico, il fluido sulculare presente intorno ad un elemento dentario affetto da parodontite, e, nello stesso paziente, il fluido presente all'interno di un solco perimplantare di un impianto affetto da perimplantite. Se più impianti sono considerati affetti da perimplantite, il partecipante sceglierà il peggiore come sito campione. Lo stesso principio verrà seguito nel caso del dente affetto da malattia parodontale. I campioni devono essere sottoposti a meta-analisi genomica batterica per la precisa identificazione del batterio. Per un migliore confronto della flora, anche un dente sano dello stesso paziente verrà scelto come sito di prova e su di esso verrà prelevato un fluido crevicolare gengivale.

Gli investigatori ritengono che la perfetta conoscenza delle specie patogene sia il punto di partenza di una corretta strategia terapeutica. Ma è molto importante tenere presente le caratteristiche individuali della microflora orale.

I dati da annotare all'inizio sono:

Segni e sintomi di malattia parodontale, con precisa inquadratura all'interno della Classificazione Armitage 1999, e malattia perimplantare. Ai fini dello studio la definizione di perimplantite riguarda un impianto con una profondità di sondaggio minima di 4 mm con sanguinamento al sondaggio e/o suppurazione (BOP e Supp) e perdita ossea radiografica (BL).

Evidenza di BL registrata in ordine di definizione dell'8° European Consensus Conference of Periodontology Working group 4: BL > 2 mm dal livello osseo previsto se era assente un rx preliminare; Rx 2-3 volte la DS del record di misura (1-1,5 mm) nel caso fosse presente un rx preliminare.

1. Rilevazioni diagnostiche radiografiche e pre-intervento eseguite con tecnica parallela (CBCT optional).
2. Fotografie pre, intra e post operatorie (se presenti)
3. Follow up fino a 6 mesi/1 anno (facoltativo) Lo studio fornisce un GCF raccolto attorno al solco parodontale e perimplantare in pazienti reclutati per indagini microbiologiche. Le analisi dei campioni vengono eseguite "alla cieca". La sonda utilizzata è una UNC15 e solo un medico calibrato esegue il sondaggio. La microflora patogena sarà confrontata con la microflora di un dente sano prelevata attorno ad un dente sano nello stesso paziente.

Il pretrattamento dei siti di campionamento al fine di evitare la contaminazione dei campioni da parte della placca batterica sopragengivale procederà come segue:

- 2 giorni prima del prelievo, il paziente viene sottoposto a pulizia professionale di coppette e spazzolini con il solo scopo di eliminare la placca sottogengivale. inoltre ci verranno fornite adeguate istruzioni di igiene orale con spazzolatura due volte al giorno e utilizzo degli altri strumenti ove richiesto.

Procedura di campionamento: Il raccolto sarà effettuato tramite carta sterile punto la misura a punta 30 e conicità ISO 4%. La tecnica di campionamento sarà quella indicata in figura e contrassegnata con la lettera c (metodo intracrevicolare profondo) fino a che non si avverta minima resistenza. Ogni punto di carta rimarrà in sede per 5 sec, quindi sarà prontamente riposto in un apposito contenitore sterile, conservato in frigorifero e consegnato entro 60 minuti all'ambiente dell'Istituto che effettuerà l'esame. Qualsiasi raccolto che mostri contaminazione del sangue sarà escluso dall'esame.

Protocollo microbiologico

1. Raccolta dei campioni e isolamento del DNA Per l'analisi metagenomica, i campioni di carta strip/paper point dei pazienti inclusi nello studio, verranno eluiti durante la notte in PBS (Phosphate Buffed Saline) a 4°C. Successivamente, i campioni verranno centrifugati a 10.000 rpm per 15 min a 4°C. Dopo la rimozione della punta di carta, il supernatante verrà utilizzato per l'estrazione del DNA utilizzando il kit QIAamp DNA Mini. Il DNA sarà quantificato con Qubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher) utilizzando QUBIT Kit dsDNA HS ASSAY KIT (Life Technologies).
2. Analisi del 16S rRNA - Metagenomica Le analisi metagenomiche saranno condotte su piattaforma MiSeq Illumina. Le librerie geniche saranno sequenziate attraverso i kit di reagenti MiSeq v3. Le regioni ipervariabili 16S rRNA saranno amplificate utilizzando una concentrazione di DNA di 5 ng/l con i primer V5-V7.

Le librerie saranno purificate mediante biglie magnetiche (AgencourtAmpure XP, Beckman), e la concentrazione e la distribuzione dei frammenti delle librerie saranno valutate su DNA Chip 1000 nel microanalizzatore 2100 (Agilent Technologies). L'analisi delle sequenze (dataset di ampliconi) e la determinazione delle OTU (OperationalTaxonomicUnits) saranno eseguite mediante pipeline QIIME utilizzando come database genico 16S rRNA i geni Green.

Criterio di inclusione:

• Beni in esercizio da almeno un anno senza GBR tecnico (quindi esclusi dallo studio anche post-estrazione)
• inserito Lavora su osso nativo
• Compilare un modulo di anamnesi e una scheda parodontale dedicata all'evento, nonché una scheda per il clinico che si basa sul lavoro pubblicato in J ClinPeriodontol 2012; 39 (Suppl. 12): 224-244
• Segnalazione nel tipo di scheda di sistema (tecnica chirurgica opzionale)

Criteri di esclusione:

• Pazienti in condizioni sistemiche subentranti che controindicano l'inserimento di impianti
• Pazienti negli ultimi tre mesi, dopo l'intervento chirurgico hanno assunto antibiotici o seguono qualsiasi terapia per la risoluzione di eventi acuti. Lo stesso può qualificarsi per lo studio in seguito.
• Donne in gravidanza o allattamento o sottoposte a terapie ormonali