Trasferimento differito di embrioni in un programma in vitro con politica di trasferimento di un singolo embrione

Lo studio è stato progettato come uno studio prospettico, randomizzato, a due bracci, parallelo, non in cieco, durante il quale i ricercatori includeranno 138 coppie (69 in ciascun gruppo) di utilizzatori di fecondazione in vitro / ICSI. I cicli annullati o perforati ma senza trasferimento di embrioni (per mancato ottenimento di ovociti, mancata fecondazione o arresto dello sviluppo embrionale) non saranno inclusi nello studio. L'assegnazione delle coppie a ciascuno dei gruppi sarà effettuata mediante una procedura di campionamento casuale consecutivo. L'elenco di randomizzazione verrà creato appositamente per questo progetto e sarà conservato in modo sicuro da qualcuno non incluso nel gruppo di ricerca:

• Gruppo I (sperimentale): non viene eseguito il trasferimento fresco, l'embrione di migliore qualità viene criopreservato. Trasferimento elettivo in un ciclo successivo dell'embrione criopreservato.
• Gruppo II (controllo): trasferimento fresco dell'embrione di migliore qualità.

Materie di studio:

Pazienti che si recano presso l'Unità di Riproduzione Umana dell'Ospedale Universitario Virgen de las Nieves per eseguire un primo o secondo ciclo di fecondazione in vitro / ICSI. Le coppie saranno selezionate in base a criteri di inclusione che le classificano come buona prognosi riproduttiva (che è coerente con la consueta pratica eSET).

Le coppie potranno partecipare allo studio per un solo ciclo. Ogni coppia sarà intervistata per spiegare le caratteristiche dello studio e verrà consegnata una Scheda informativa. Il consenso informato scritto deve essere ottenuto da ogni coppia. La persona esterna al gruppo di ricerca che custodisce l'elenco di randomizzazione assegnerà il gruppo di trattamento corrispondente.

Prima di iniziare lo studio, l'approvazione etica è stata elaborata dal Comitato Etico attraverso il Portale Etico per la Ricerca Biomedica dell'Andalusia.

Al fine di valutare l'ipotesi nulla che comprende l'uguaglianza dei tassi di natalità vivi nel gruppo delle donne che effettuano un trasferimento elettivo differito di un singolo embrione e nel gruppo che effettua un trasferimento elettivo di un embrione fresco, è stata calcolata una potenza dell'80%. stabilito per rilevare differenze statisticamente significative mediante un test Chi-quadro bilaterale per due campioni indipendenti, tenendo conto che il livello di significatività è del 5% e assumendo che la percentuale nel gruppo di donne che subiscono un nuovo trasferimento sia del 50,9% , la quota nel gruppo delle donne che ricevono il trasferimento elettivo differito è del 78%, e che la quota delle donne rispetto al totale è del 50%, sarà necessario includere 48 donne in ciascun gruppo, con l'obiettivo di ottenere 96 unità sperimentali nello studio. Tenendo conto che il tasso di abbandono previsto è di tre donne su dieci, sarà necessario includere 69 donne per gruppo. Le 138 donne saranno assegnate ad uno dei gruppi mediante una procedura casuale, seguendo una sequenza di numeri casuali generati da un software specifico (Epidat, Epidemiological Data Analysis Program Tabulated. Versione 3.1).

Metodologia Le pazienti devono seguire un trattamento di stimolazione dell'ovulazione, al fine di ottenere uno sviluppo follicolare multiplo. Verrà utilizzato un cosiddetto protocollo agonista del GnRH "analogico lungo". Consiste nel somministrare dal giorno 22 del ciclo 0,1 mg/giorno di analogo del GnRH (Decapeptyl 0,1; Lasa, Barcellona, ​​Spagna) fino al giorno in cui si inizia la somministrazione della gonadotropina, in cui la dose viene ridotta al 50% fino al giorno giorno dell'hCG. Dopo 10-14 giorni di somministrazione dell'agonista si controlla il contenimento ipofisario mediante ecografia ovarica vaginale (assenza di follicoli e cisti) e determinazione sierica dell'estradiolo (<50 pg/mL). Se questa ipofisectomia medica è confermata, vengono somministrate 300 UI di FSH ricombinante (FSHr) al giorno (Gonal F, Serono, Madrid, Spagna) per due giorni e 150 UI di FSHr dal 3° al 7° giorno. In questo giorno, vengono eseguiti il ​​monitoraggio ecografico dello sviluppo follicolare e la determinazione dell'estradiolo sierico per regolare ancora una volta la dose di rFSH per ciascun paziente. Una volta che la risposta follicolare è adeguata (più di 3 follicoli ovarici superiori a 18 mm di diametro), l'ovulazione viene attivata utilizzando 6.500 UI di hCG (Ovitrelle, Merck, Darmstadt, Germania).

Verranno quindi eseguite la fecondazione in vitro / ICSI e la coltura dell'embrione. Per eseguire la microinseminazione degli spermatozoi (ICSI) è necessario rimuovere il cumulo e la corona irradiata dall'ovocita. Per decumulare, il complesso corona-ovocita viene immerso in una soluzione con 80 IU/mL di ialuronidasi (HYASE, IVF Science Scandinavia, Göteborg, Svezia) per 10-20 secondi, aspirando più volte il complesso utilizzando una pipetta pasteur. La tecnica di microinseminazione viene eseguita al microscopio invertito con micromanipolatori e microiniettori Eppendorf e Narishigue. La fecondazione in vitro (IVF) viene eseguita in una piastra a cinque pozzetti, depositando 0,5 mL di terreno IVF (Vitrolife, Svezia) e 0,5 mL di Ovoil (Vitrolife, Svezia) in ciascun pozzetto. Si lasciano cinque cumuli per pozzetto e si aggiungono 100.000 spermatozoi/mL. In entrambi i casi, gli ovociti vengono coltivati ​​in un incubatore Thermo-Fisher, all'interno di una piattaforma morfocinetica (PrimoVision) che li fotografa ogni 5-10 minuti. I giorni successivi vengono valutati per la classificazione, scegliendo quello con il miglior potenziale di impianto in base ai tempi di divisione misurati dalla morfocinetica e ai criteri morfologici dell'Associazione spagnola per lo studio della biologia della riproduzione (ASEBIR) rivisti nel 2015.

Il trasferimento embrionale verrà effettuato nel gruppo 2 il terzo giorno scegliendo l'embrione migliore secondo i criteri precedenti. Nel gruppo 1, gli embrioni saranno criopreservati mediante vitrificazione, selezionando il migliore per il trasferimento ritardato. Il mezzo di vitrificazione commerciale (Medicult Vitrification, Danimarca) e il dispositivo di conservazione saranno Cryoleaf (McGill Cryoleaf, Medicult, Danimarca). Tutti gli embrioni crioconservati saranno conservati in azoto liquido a -196ºC in cilindri di stoccaggio (Air Liquide, Francia). Il giorno prima del criotransfer l'embrione viene devetrificato, utilizzando il kit di scongelamento (Medicult Warming, Danimarca). Al termine, l'embrione viene lavato in terreno G2 (Vitrolife), lasciandolo in coltura fino al giorno successivo, dopo aver valutato la qualità dell'embrione e la criosopravvivenza (percentuale di cellule lisate). L'endometrio della donna viene preparato mediante trattamento con estradiolo valerato e progesterone. Il giorno del criotransfer, la qualità dell'embrione viene nuovamente valutata, con enfasi sulla divisione dell'embrione. Il criotrasferimento viene eseguito utilizzando la stessa tecnica del trasferimento.

Limitazioni dello studio Il progetto è stato condotto tenendo conto delle risorse disponibili nell'Unità di Riproduzione Umana dell'Ospedale Universitario Virgen de las Nieves, e quindi non sembrano esserci limitazioni al riguardo.

Lo studio potrebbe essere completato effettuando una diagnosi genetica preimpianto per determinare se ci sono alterazioni genetiche embrionali prima del trasferimento intrauterino, ma questa tecnica non è ancora eseguita nella nostra Unità. Allo stesso modo, il trasferimento di blastocisti può aumentare i tassi di gravidanza, ma aumentando il tasso di cancellazione del trasferimento embrionale, quindi non viene eseguito di routine nella nostra Unità.