Marcatori di superficie delle vescicole extracellulari nelle sindromi cerebrovascolari acute. (ElViS-ACS)
Le implicazioni cliniche di eventuali biomarcatori ematici per la diagnosi e la prognosi dell’ictus sarebbero limitate, principalmente perché la valutazione clinica e le scale (che forniscono la gravità dell’ictus) o il neuroimaging (che forniscono la dimensione accurata della lesione) sono predittori più affidabili per la previsione dell’esito clinico. Nella pratica clinica sarebbe più utile trovare un biomarcatore, che possa aiutare ad orientare il medico in condizioni in cui il quadro clinico e l’imaging forniscono un supporto limitato.
Gli attacchi ischemici transitori (TIA) rappresentano un classico esempio per il quale un biomarcatore sarebbe di interesse per confermare e distinguere un processo ischemico cerebrale da un ictus mimo. Sono stati studiati i biomarcatori diagnostici del TIA, ma nessuno dei potenziali candidati ha raggiunto un’accuratezza sufficiente per la diagnosi del TIA. Il nostro gruppo ha scoperto che le vescicole extracellulari (EV) potrebbero essere utili come biomarcatori per rilevare l'ischemia cerebrale nei pazienti con TIA perché il profilo dell'antigene di superficie EV sembra essere diverso nei pazienti con sintomi transitori, ritenuti molto probabilmente causati da ischemia cerebrale, rispetto ai pazienti i cui sintomi erano meno probabili a causa di ischemia cerebrale. Il nostro studio ha suscitato interesse nella comunità scientifica riconoscendo il ruolo promettente dell’analisi degli EV derivati dal sangue nell’ampliare le possibilità di diagnosticare e classificare correttamente gli eventi TIA e di ictus, discriminandoli dai TIA o dagli ictus mimi, con importanti implicazioni future nella gestione e nella terapia dei pazienti con sindrome cerebrovascolare ischemica acuta. la validità del nostro approccio deve essere testata in uno studio più ampio, prospettico e multicentrico.
Panoramica dello studio
Stato
Intervento / Trattamento
Descrizione dettagliata
Caratterizzazione delle vescicole extracellulari Le vescicole extracellulari (EV) saranno caratterizzate in campioni di siero pre-puliti (vedi trasferimento e gestione dei campioni di sangue). Gli EV saranno caratterizzati mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle, western blot, citometria a flusso basata su microsfere (approccio diretto e inverso) ed ELISA.
Valuteremo il diametro e la concentrazione delle nanoparticelle sieriche (NP) mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) utilizzando NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Regno Unito) dotato di un laser da 405 nm e del software analitico Nanoparticle Tracking Analysis NTA 2.3. Una telecamera registrerà il movimento browniano degli EV e la dimensione e il numero di EV per ml saranno calcolati mediante l'equazione di Stokes-Einstein. Per ogni analisi verranno registrati tre video di 60 secondi.
L'analisi Western Blot sarà effettuata sul lisato proteico dopo immuno-cattura dell'EV (usando sfere ricoperte con anticorpi contro le tetraspanine specifiche dell'EV, CD9, CD63 e CD81). Blot di campioni rappresentativi verranno incubati con anticorpi primari contro marcatori specifici espressi sulla superficie o all'interno di EV (TSG101, Syntenin-1, CD81, Alix) e potenziali contaminanti (GRP94, Apolipoproteina A1, Apolipoproteina B48).
La profilazione EV verrà eseguita utilizzando un test citometrico a flusso standardizzato basato su perline multiplex, utilizzando il kit MACSPlex Human Exosome (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germania), come descritto in precedenza. 22 Verrà eseguita simultaneamente la rilevazione di 37 diversi antigeni di superficie comunemente espressi sulla membrana dell'EV (inclusi marcatori di piastrine attivate, endotelio e cellule infiammatorie). Lo sfondo verrà sottratto dal valore MFI di ciascun marcatore e quindi normalizzato utilizzando i livelli medi di intensità di fluorescenza (MFI) di CD9, CD63 e CD81. I livelli di espressione saranno riportati come MFI normalizzato (nMFI; %) per ciascun antigene di superficie EV (valore mediano e intervallo interquartile).
Dopo uno screening iniziale mediante test multiplex, i singoli biomarcatori EV candidati saranno confermati mediante citometria a flusso inverso e tecniche ELISA.
Il test citometrico a flusso inverso verrà eseguito isolando gli EV mediante sfere di cattura rivestite con anticorpi contro CD9-CD63-CD81 (EpCam; JSR Micro) e quindi incubate con anticorpi coniugati con fluorocromo contro singoli antigeni di superficie degli EV, associati alla diagnosi del paziente durante la fase iniziale screening mediante test MACSPlex. Le sfere incubate con anticorpi corrispondenti all'isotipo e le sfere incubate in assenza di vescicole fungeranno da controlli. I biomarcatori EV candidati saranno confermati anche mediante tecnica ELISA, utilizzando anticorpi specifici secondo le istruzioni del produttore.
Tipo di studio
Iscrizione (Stimato)
Contatti e Sedi
Contatto studio
- Nome: Carlo Walter Cereda, PI
- Numero di telefono: +41918116691
- Email: carlo.cereda@eoc.ch
Backup dei contatti dello studio
- Nome: Giovanni Bianco
- Numero di telefono: +41918117073
- Email: giovanni.bianco@eoc.ch
Luoghi di studio
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Ticino
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Lugano, Ticino, Svizzera, CH-6900
- Reclutamento
- Neurocenter of Southern Switzerland, Ospedale Civico
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Investigatore principale:
- Carlo Cereda
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Contatto:
- Carlo Cereda, MD
- Numero di telefono: +41 91 811 6691
- Email: carlo.cereda@eoc.ch
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Sub-investigatore:
- Giovanni Bianco
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Sub-investigatore:
- Lucio Barile
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Criteri di partecipazione
Criteri di ammissibilità
Età idonea allo studio
- Adulto
- Adulto più anziano
Accetta volontari sani
Metodo di campionamento
Popolazione di studio
Descrizione
Criterio di inclusione:
Colpiti da:
I. Sospetto ictus ischemico minore (perdita acuta della funzione cerebrale focale di presunta eziologia vascolare e NIHSS ≤327, 28) entro 48 ore dall'esordio dei sintomi o II. TIA (definito come insorgenza acuta di sintomi neurologici focali della durata <24 ore e che si presume sia causato da ischemia cerebrale al momento del rinvio)19 III. Sintomi che imitano I. o II. con ma con alto sospetto che una condizione non ischemica sia la causa dell'evento;
2) età ≥18 anni; 3) se la risonanza magnetica cerebrale verrà eseguita entro 48-72 ore dal ricovero; 4) se la TC/RM al basale è senza emorragia; 5) se è stato ottenuto il consenso informato.
Criteri di esclusione:
- TIA oculare (amaurosi fugax);
- controindicazioni per la risonanza magnetica;
- gravidanza;
- concomitante malattia infiammatoria acuta/cronica (ad es. infezioni, malattie autoimmuni);
- malattie ematologiche concomitanti;
- Infezione del sistema nervoso centrale entro 30 giorni;
- grave trauma cranico entro 30 giorni;
- intervento chirurgico maggiore entro 90 giorni.
Piano di studio
Come è strutturato lo studio?
Dettagli di progettazione
Coorti e interventi
Gruppo / Coorte |
Intervento / Trattamento |
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Colpo
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I pazienti vengono sottoposti a un campione di sangue per l'analisi degli EV: gli EV saranno caratterizzati mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle, western blot, citometria a flusso basata su microsfere (approccio diretto e inverso) ed ELISA. Valuteremo il diametro e la concentrazione delle nanoparticelle sieriche (NP) mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) utilizzando NanoSight LM10. L'analisi Western Blot sarà effettuata sul lisato proteico dopo immuno-cattura dell'EV (usando sfere ricoperte con anticorpi contro le tetraspanine specifiche dell'EV, CD9, CD63 e CD81). La profilazione EV verrà eseguita utilizzando un test citometrico a flusso standardizzato basato su perline multiplex, utilizzando il kit MACSPlex Human Exosome (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germania), come descritto in precedenza. 22 Verrà eseguita simultaneamente la rilevazione di 37 diversi antigeni di superficie comunemente espressi sulla membrana dell'EV (inclusi marcatori di piastrine attivate, endotelio e cellule infiammatorie). |
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TIA
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I pazienti vengono sottoposti a un campione di sangue per l'analisi degli EV: gli EV saranno caratterizzati mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle, western blot, citometria a flusso basata su microsfere (approccio diretto e inverso) ed ELISA. Valuteremo il diametro e la concentrazione delle nanoparticelle sieriche (NP) mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) utilizzando NanoSight LM10. L'analisi Western Blot sarà effettuata sul lisato proteico dopo immuno-cattura dell'EV (usando sfere ricoperte con anticorpi contro le tetraspanine specifiche dell'EV, CD9, CD63 e CD81). La profilazione EV verrà eseguita utilizzando un test citometrico a flusso standardizzato basato su perline multiplex, utilizzando il kit MACSPlex Human Exosome (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germania), come descritto in precedenza. 22 Verrà eseguita simultaneamente la rilevazione di 37 diversi antigeni di superficie comunemente espressi sulla membrana dell'EV (inclusi marcatori di piastrine attivate, endotelio e cellule infiammatorie). |
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Mimica del tratto
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I pazienti vengono sottoposti a un campione di sangue per l'analisi degli EV: gli EV saranno caratterizzati mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle, western blot, citometria a flusso basata su microsfere (approccio diretto e inverso) ed ELISA. Valuteremo il diametro e la concentrazione delle nanoparticelle sieriche (NP) mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) utilizzando NanoSight LM10. L'analisi Western Blot sarà effettuata sul lisato proteico dopo immuno-cattura dell'EV (usando sfere ricoperte con anticorpi contro le tetraspanine specifiche dell'EV, CD9, CD63 e CD81). La profilazione EV verrà eseguita utilizzando un test citometrico a flusso standardizzato basato su perline multiplex, utilizzando il kit MACSPlex Human Exosome (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germania), come descritto in precedenza. 22 Verrà eseguita simultaneamente la rilevazione di 37 diversi antigeni di superficie comunemente espressi sulla membrana dell'EV (inclusi marcatori di piastrine attivate, endotelio e cellule infiammatorie). |
Cosa sta misurando lo studio?
Misure di risultato primarie
Misura del risultato |
Misura Descrizione |
Lasso di tempo |
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Differenziazione del TIA dai mimi del TIA
Lasso di tempo: 72 ore dalla comparsa dei sintomi
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determinare le prestazioni del profilo EV (analisi degli antigeni espressi sulla superficie delle vescicole), aggiunto a una valutazione clinica strutturata (punteggio PREDISC) e di imaging (MRI cerebrale), per discriminare i TIA dai mimi di TIA (eventi non ischemici).
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72 ore dalla comparsa dei sintomi
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Misure di risultato secondarie
Misura del risultato |
Misura Descrizione |
Lasso di tempo |
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Differenziazione del TIA dall'ictus
Lasso di tempo: fase acuta, 3 e 12 mesi
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determinare le prestazioni del profilo EV per differenziare tra TIA (con MRI negativa per lesione acuta) e ictus ischemici acuti (AIS, confermati con MRI).
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fase acuta, 3 e 12 mesi
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Eziologia dell'ictus
Lasso di tempo: fase acuta, 3 e 12 mesi
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determinare le prestazioni della profilazione dei veicoli elettrici per classificare cause pre-specificate di eventi ischemici
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fase acuta, 3 e 12 mesi
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Collaboratori e investigatori
Sponsor
Studiare le date dei record
Studia le date principali
Inizio studio (Effettivo)
Completamento primario (Stimato)
Completamento dello studio (Stimato)
Date di iscrizione allo studio
Primo inviato
Primo inviato che soddisfa i criteri di controllo qualità
Primo Inserito (Effettivo)
Aggiornamenti dei record di studio
Ultimo aggiornamento pubblicato (Effettivo)
Ultimo aggiornamento inviato che soddisfa i criteri QC
Ultimo verificato
Maggiori informazioni
Termini relativi a questo studio
Termini MeSH pertinenti aggiuntivi
Altri numeri di identificazione dello studio
- NSISTRCR_2201
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