Rilevazione di Mycobacterium Tuberculosis nel sangue di pazienti affetti da tubercolosi e dei loro contatti in Uganda (MICRO-LTBI_UG)

Per molti anni, lo sviluppo di un test di questo tipo non è stato considerato realistico a causa della natura paucibacillare dell’LTBI e dell’incertezza riguardo alla localizzazione cellulare dei bacilli Mtb nell’LTBI. Tuttavia, noi e altri abbiamo recentemente riferito che il DNA di Mtb può essere rilevato nel sangue periferico di contatti di tubercolosi latentemente infetti sia in contesti ad alto che a basso carico. Nei nostri studi, che hanno utilizzato la reazione a catena della polimerasi digitale (dPCR) per rilevare il DNA di Mtb nei sottogruppi di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) di contatti con tubercolosi in Etiopia, il segnale è stato rilevato più frequentemente negli estratti di PBMC CD34+ (cellule staminali ematopoietiche [HSC] e i loro progenitori) rispetto a CD34-PBMC, ma non era limitato a loro. La somministrazione della terapia preventiva con isoniazide (IPT) ha ridotto la percentuale di partecipanti in cui il DNA di Mtb poteva essere rilevato nelle PBMC, dimostrando che questo segnale è dinamico e suggerendo che la presenza di DNA di Mtb può riflettere la presenza di bacilli vitali. Abbiamo anche sequenziato il DNA di Mtb negli estratti PBMC utilizzando il sequenziamento mirato di nuova generazione (tNGS) per rivelare mutazioni che conferiscono resistenza ai farmaci antimicrobici.

Questi entusiasmanti risultati dimostrano il potenziale per lo sviluppo di un NAAT per il rilevamento e il test genomico della resistenza ai farmaci dell'LTBI nel sangue periferico. Tuttavia, rimangono dubbi riguardo se il rilevamento del DNA di Mtb nel sangue di individui sintomatici sia associato alla capacità di visualizzare o coltivare bacilli nel sangue, cosa che è stata effettuata in pazienti con tubercolosi attiva. Inoltre, il nostro metodo esistente per il rilevamento del DNA di Mtb in PBMC CD34+ utilizzando dPCR non è attualmente adatto per l'uso sul campo, poiché i campioni richiedono una lunga elaborazione in laboratorio. La piattaforma GeneXpert, che può fornire risultati in meno di 2 ore, è stata precedentemente utilizzata per rilevare il DNA di Mtb nel sangue intero di pazienti infetti da HIV con tubercolosi attiva. Sensibilità del test Xpert® MTB/RIF Ultra (Xpert Ultra, che ha un limite di rilevamento [LOD] di 15,6 unità formanti colonie [CFU]/ml rispetto a 112,6 CFU/ml del [test Xpert® MTB/RIF] originale) è sufficiente per rilevare il DNA di Mtb nell'intervallo dimostrato nel sangue dei contatti di tubercolosi latentemente infetti in Etiopia e Uganda (da 20 a 1000 copie di rpoB in la maggior parte degli individui Mtb DNA positivi). Tuttavia, il rilevamento di Mtb nel sangue di individui con infezione latente non è stato precedentemente tentato utilizzando questa piattaforma. Infine, desideriamo espandere le conoscenze confrontando il rilevamento del DNA di Mtb nei contatti tubercolari recenti e storici e includendo pazienti con tubercolosi attiva come gruppo di controllo positivo.

Proponiamo quindi di condurre uno studio per confrontare la sensibilità di diverse metodologie per il rilevamento di Mtb e della resistenza genomica ai farmaci nel sangue periferico di pazienti affetti da tubercolosi e di contatti asintomatici recentemente esposti a distanza a Kampala, in Uganda.

Obiettivi dello studio Obiettivo primario

L'obiettivo primario di questo studio è determinare se il Mycobacterium tuberculosis (Mtb) può essere rilevato nel sangue dei recenti contatti con tubercolosi, reclutati a Kampala, in Uganda, utilizzando uno dei seguenti metodi:

• PCR digitale
• GeneXpert® MTB/RIF Ultra (Cefeide)
• Microscopia a fluorescenza
• Coltura del sangue
• Sequenziamento mirato di nuova generazione

Obiettivi secondari

Gli obiettivi secondari di questo studio sono:

1. Determinare se Mtb persiste nel sangue dei contatti remotamente esposti alla tubercolosi (storici), reclutati nello stesso contesto e utilizzando gli stessi metodi.
2. Determinare se Mtb può essere rilevato nel sangue di pazienti con tubercolosi attiva di nuova diagnosi, reclutati nello stesso contesto e utilizzando gli stessi metodi.

3. Stabilire se il rilevamento di Mtb nel sangue utilizzando i metodi sopra indicati si associa a uno qualsiasi dei seguenti biomarcatori della risposta immunitaria dell'ospite:

   • QFT Plus
   • Firme di RNA del sangue per tubercolosi incipiente
   • Profili anticorpali
4. Determinare se i ceppi di Mtb isolati dall'espettorato/sangue dei casi indice di tubercolosi polmonare siano geneticamente identici a quelli rilevati nel sangue dei loro recenti contatti.

Endpoint primario Proporzione di pazienti affetti da tubercolosi e loro contatti in cui il DNA di Mtb può essere rilevato nel sangue periferico mediante PCR digitale.

Endpoint secondari

1. Proporzione di pazienti affetti da tubercolosi e loro contatti in cui il DNA di Mtb può essere rilevato nel sangue periferico utilizzando i seguenti metodi:

   • GeneXpert® MTB/RIF Ultra (Cefeide)
   • Microscopia a fluorescenza
   • Coltura del sangue
   • Sequenziamento mirato di nuova generazione

2. Proporzione di pazienti affetti da tubercolosi e dei loro contatti con risultati positivi per uno dei seguenti test:

   • QFT Plus
   • Firme di RNA del sangue per tubercolosi incipiente
   • Profili anticorpali
3. Sequenze genetiche di ceppi di Mtb isolati dall'espettorato/sangue di casi indice con tubercolosi polmonare e sangue di questi partecipanti e dei loro contatti familiari asintomatici.