Effetto integratori di ferro sui livelli di B-PHE nei pazienti con PKU durante 3 anni studio (ISPEK)

Introduzione: Phenylketonuria (PKU) (OMIM 261600) è una malattia metabolica congenita autosomica recessiva con una media di circa 1: 10.000 neonati, caratterizzata dall'accumulo di PHE nel corpo a causa della carenza di PAH, la maggior parte dei casi (98%) di PKU/ PKU/ L'HPA deriva da mutazioni nel gene della fenilalanina idrossilasi (PAH) che si trova sul cromosom E 12Q24.1, che portano ad un enzima PAH carente o assente (EC 1.14.16.1). I casi rimanenti (2%) derivano a causa di un blocco nel metabolismo del tetraidrobiopterina (BH4) il cofattore PAH. I livelli ematici normali di PHE sono <120 mmol/L, in base alle concentrazioni di PHE nel sangue, la carenza di PAH può essere classificata in PKU classico (PHE> 1200 μmol/L), lieve PKU (PHE = 600-1200 μmol/L) e lieve iperfeninemia iperfenilalaninemia (MHP) (PHE = 120 - <600 μmol/L). Un'alta concentrazione di PHE nel sangue (> 360 μmol/L) in età neonatale, potrebbe portare a danni cerebrali irreversibili, ma può essere prevenuto dalla diagnosi precoce, grazie allo screening neonato e all'iniziazione delle diete limitate al PHE.

La principale fonte di nutrienti naturali, in particolare ferro (FE), vitamina B12 (VIT B12) e vitamina D (VIT D) nella dieta per bambini normali sono alimenti contenenti proteine; Quindi, la sua restrizione nella gestione dietetica del PKU può portare a carenza di elementi essenziali, anemia, difetti neurologici irreversibili e incapacità di prosperare. Al giorno d'oggi, questi elementi possono essere integrati attraverso una terapia dietetica speciale. La diagnosi di HPA viene effettuata sulla base di un'elevata concentrazione di PHE ematica su un campione di sangue ripetuto confermata geneticamente. Il limite di riferimento superiore per PHE nel sangue intero o nel plasma nei neonati è di 120 μmol/L (9). Tutti i pazienti, allo screening del neonato, con livelli di PHE plasmatica, superiori a 360 μmol/L, devono iniziare la terapia dietetica PHE a bassa e controllata limitata (RLCPDT) il più presto possibile per prevenire complicanze sopra menzionate. Lo schema dietetico include anche altre integrazioni di acido docosaesaenoico (DHA), vitamine e altri nutrienti. Fe non è ancora considerata una supplementazione raccomandata per i pazienti con PKU, sebbene la maggior parte dei nostri pazienti sia soppiantato con questo micronutriente a causa della scoperta di anemia. Gli investigatori hanno notato che i pazienti soppiantati di ferro hanno di conseguenza hanno ridotto i livelli plasmatici di PHE. Ciò può essere concesso al fatto che gli investigatori hanno realizzato questo studio per confermare la relazione di integrazione di ferro con i livelli di P-PHE.

L'enzima PAH è tetramerico e contiene tre domini principali tra cui un dominio regolatorio, una piccola tetramerizzazione e un dominio catalitico che contiene il sito attivo che include un gruppo protesico di ferro ferroso (Fe) legato a tre residui amminoacidici carichi. Affinché l'enzima PAH svolga correttamente la sua funzione di idrossilazione, richiede la presenza di ferro, ossigeno e un cofattore, la tetraidrobiopterina (BH4) per l'idrossilasi Phe in Tyr.

Sulla base di queste considerazioni strutturali e funzionali, si ipotizza che l'integrazione di ferro nei pazienti con PKU possa migliorare l'attività dell'enzima PAH, riducendo di conseguenza i loro livelli ematici di PHE. Alla coscienza del ricercatore questo studio è il primo ad essere applicato ai pazienti umani PKU.

Studi frontali su ferro e PKU: J. L. Bodley, in uno studio retrospettivo ha rivelato un'alta incidenza di scarse riserve di ferro in 53 pazienti affetti da PKU con dieta a basso contenuto di fenilalanina. Questi risultati suggeriscono che l’attuale gestione dietetica della PKU è associata ad un aumento del rischio di deplezione delle riserve di ferro.

Mackler et al, hanno analizzato uno studio di osservazione preclinico che ha evidenziato che le concentrazioni plasmatiche di fenilalanina (P-Phe) erano marcatamente elevate nei ratti con carenza di ferro e sembravano variare direttamente con il grado di carenza di ferro. Le concentrazioni plasmatiche di Phe sono tornate ai livelli di controllo entro una settimana dopo il trattamento con ferro dei ratti con carenza di ferro. I livelli elevati di P-Phe probabilmente non sono stati causati da una carenza di PAH epatico poiché i livelli di attività dell'enzima sono risultati normali nei fegati degli animali analizzati.

Gropper SS et al, hanno dimostrato che le concentrazioni di p-PHE sono associate al contenuto di ferro epatico in un modello murino per la fenilchetonuria.

La combinazione ferrosa bisglicinata (FB) e alginato di sodio (SA) è la prima scelta come supplementazione di ferro: il ricercatore ha fatto ricerche acute sui vari tipi di integrazioni di ferro disponibili nel commercio. Dopo che sono state condotte analisi profonde, i chelati di aminoacidi di ferro, poiché il gruppo chelati di glicinati di ferro (IGC), vengono sviluppati per essere utilizzati come fortificanti alimentari e agenti terapeutici nella prevenzione e nel trattamento dell'anemia da carenza di ferro. L'assorbimento di ferro da biscotto bisglicinato (FB) è regolato attraverso gli stessi meccanismi fisiologici di altre forme inorganiche di ferro. Dopo la somministrazione orale, FB contribuisce al pool intrastinale intraluminale di ferro non eme inorganico e viene assorbito intatto nelle cellule della mucosa dell'intestino. Successivamente, viene idrolizzato nei suoi componenti di ferro e glicina. La sua sicurezza e la massima assunzione tollerabile sono stati rivisti e valutati da numerosi comitati scientifici.

Il fattore importante che ci aiuta a scegliere FB è che è stato utilizzato nella fortificazione degli alimenti che forniscono tra 2 e 23 mg/giorno di ferro dietetico supplementare senza alcun rapporto di effetti avversi. Inoltre, FB è stato ben tollerato come integratore di ferro alimentare, fornendo circa 15-120 mg di ferro al giorno, in vari gruppi di popolazione, tra cui maschi adulti, femmine in gravidanza, femmine non gravite con livelli di ferro normale e in particolare tra i ferro -Il bambini piccoli carenti.

La stabilità di FB (mediante l'aggiunta del prodotto a latte, yogurt, farina di mais e margarina) e la mancanza di potenziale per l'interazione di FB con questi alimenti (perossidazione lipidica) sono stati testati a vari momenti/temperature. Non ci sono prove per indicare il verificarsi di reazioni di FB con componenti di questi alimenti e si conferma che FB fornisce una fonte di ferro altamente bio-disponibile e stabile.

FB è protetto dall'interazione con gli inibitori alimentari dell'assorbimento del ferro come il fitato e l'assorbimento del ferro da questa molecola è normalmente sottoregolato con l'aumento delle riserve di ferro.

La combinazione della formula di integrazione orale (FB + SA) ha dimostrato di essere più biodisponibile, più sicura e di buon gusto rispetto al solo FB. Poiché (FB + SA) sono presenti in rapporto 1 a 1, ogni piccola particella della polvere presenta la stessa morfologia e quantità delle due diverse sostanze coprocessate. Il nuovo "composto co-processato", ottenuto mediante tecnologia atomizzazione, conferisce alla polvere di ferro un'area superficiale aumentata ed uniforme e, di conseguenza, un rapido e più esteso assorbimento del ferro unitamente ad una aumentata protezione gastrointestinale. Allo stesso tempo, la presenza uniforme di SA in questo prodotto, consente al FBC di essere rilasciato più costantemente e lentamente rispetto al solo FB e consente ai recettori del trasportatore di metalli divalenti 1 (DMT-) di assorbire meglio il ferro. La saturazione del recettore DMT1 potrebbe rappresentare un limite nella biodisponibilità del ferro orale che potrebbe essere superato da FERALGINE (FB + SA). Infatti, la lenta disponibilità del ferro mediante la somministrazione di FB+ SA potrebbe comportare un’insaturazione del DMT-1 con la conseguenza di un aumento della biodisponibilità del ferro.

Analisi del prodotto bisglicinata in ferro: considerando le nostre precedenti esperienze cliniche con FB da solo negli anni precedenti e le nostre esperienze con il nuovo composto contenente una sostanza co-processata da tecnologia a spruzzo (FB + SA chiamato Feraline) in un rapporto 1 a 1 a supporto di più biodisponibilità e meno eventi avversi gastrointestinali per questa ricerca che gli investigatori hanno deciso di utilizzare solo bustine effervescenti selvagge.

La nostra esperienza clinica è stata anche supportata dalla letteratura pubblicata. Il ricercatore ha deciso di escludere la capsula orale e le forme di compresse perché i bambini hanno difficoltà a deglutire questi preparazioni ed escludere le cadute orali perché non è adattato ad adolescenti e pazienti adulti con conseguente bassa conformità domiciliale, in particolare per uso a lungo termine, considerando la formulazione dell'effervescente cenno bustine contenenti selvaggi (FB + SA), un composto più biodisponibile, con elevata tollerabilità gastrointestinale, più gusti e in grado di aumentare la conformità domiciliare soprattutto per l'uso a lungo termine, gli investigatori hanno deciso di utilizzare solo una preparazione di Feralini disponibili contenenti sachet effervescenti con 14 mg di ferro elementare in base all'età e al peso del paziente.

Pazienti e metodi:

• Popolazione in studio Lo studio è stato condotto come uno studio clinico interventistico longitudinale, randomizzato, ad assegnazione parallela, della durata di 3 anni, che ha coinvolto 84 pazienti con PKU in terapia dietetica con apporto basso e controllato di Phe diviso in due gruppi, 42 pazienti (gruppo A) con integrazione di ferro rispetto ad altri 42 pazienti (gruppo B) senza integrazione di ferro.
• Dimensione del campione e randomizzazione La dimensione del campione è stata calcolata in base alla durata dello studio, alla disponibilità, all'eterogeneità dei pazienti e alle nostre risorse. Per rilevare una variazione pari o superiore al 20% dei livelli medi di Phe plasmatica alla fine del periodo di intervento nel gruppo trattato con ferro rispetto al gruppo di controllo. Per questi sono stati reclutati 84 bambini (42 per gruppo).

Una sequenza di blocchi generata dal computer equilibrata in modo assegnato casualmente a due diversi gruppi di 42 pazienti per ciascuno. Un investigatore indipendente ha generato la sequenza di randomizzazione separata dal ricercatore. https://www.sealedenvelope.com è stato utilizzato per la generazione degli elenchi di randomizzazione. I bambini sono stati assegnati al gruppo di intervento (A) o al gruppo di controllo (b) attraverso elenchi stratificati per sesso e età (3-6, 7-10, 11-14, 15-25 anni), in blocchi di 4 unità.

L'impostazione dei partecipanti: lo studio è stato approvato dal Comitato etico italiano (Asst -Santi Paolocarlo), Protocollo n. 43183/2019 in data 10/10/2019 e tutti i partecipanti o il loro rappresentante legale approvato e firmato il consenso scritto informato su Giorno delle iscrizioni. Tutti i partecipanti allo studio hanno soddisfatto l'ammissibilità allo studio.

Tutte le procedure sperimentali hanno aderito alla dichiarazione di Helsinki e tutte le valutazioni sono state eseguite dal personale medico addestrato. Il presente studio è stato esaminato da pazienti con PKU di età compresa tra 3 e 25 anni, diagnosticati e seguiti dall'Asst Santi Paolo e Carlo, Dipartimento di Pediatria dell'ospedale di San Paolo a Milano, il Lombardy Regional Center.

La durata della supplementazione di ferro è durata per 3 mesi consecutivi per ciascun paziente nel gruppo A. 3 controlli clinici ed ematologici sono stati eseguiti a T0 (giorno di iscrizione), T3 (3 mesi da T0) e T6 (6 mesi da T0). Questo studio contiene 84 gruppi di ferro (A = 42) e (b = 42) gruppo di controllo. Poiché il nostro protocollo attivo presso il Centro metabolico, il paziente deve eseguire un campione di sangue / carta Guthrie ogni mese per misurare solo i livelli PHE, TYR e il rapporto PHE / TYR con metodi standardizzati. Ciò consente al ricercatore di aggiungere 4 campioni di goccia di sangue raccolti con la scheda Guthrie (T1, T2, T4 e T5) per ciascun paziente per lungo lo studio. È chiaro ora che ogni partecipante è stato sottoposto a raccolte di campioni di sangue su T0, T3 e T6 e raccolte di campioni di caduta di sangue in T1, T2, T4 e T5 usando la scheda Guthrie (TG). Una sequenza di blocchi generata dal computer equilibrata in modo assegnato in modo casuale a due diversi gruppi di 42 pazienti. L'investigatore che ha generato la sequenza di randomizzazione era indipendente dallo staff di ricerca. Il calcolo dell'energia e la preparazione della dieta sono in base ai "livelli di assunzione di riferimento di nutrienti ed energia per la popolazione italiana (LARN)" e RDA (indennità giornaliera raccomandata dagli Stati Uniti). I pazienti sono stati informati attraverso il modulo di consenso su tutti i dettagli dello studio. Il ricercatore ha chiarito che l'integrazione di ferro è stata fornita ai pazienti allo scopo di studiare i livelli di "PHE", stress ossidativo e reazioni infiammatorie e non per il trattamento dell'anemia prima di iscriversi a questo studio.

Valori normali delle analisi del sangue (ASST-Santi Paolo e Carlo - Milano): Fenilalanina Phe Umol/L (n.v < 120), Tirosina Tyr Umol/L (n.v 30-120), Rapporto PHE/TYR (n.v <0,9) Intervento e integratori: la quantità di ferro supplementare è stata decisa per i pazienti in base al fabbisogno giornaliero (8-18 mg/die), secondo LARN 2012 e (RDA) per il ferro. Questo studio ha preso in considerazione anche la raccomandazione del foglio illustrativo sugli integratori alimentari di ferro del National Institutes of Health come riferimento per calcolare la dose di ferro per i nostri candidati perché questa dose non è contro LARN ed è più pratica da applicare.

Viene applicato il valore RDA minimo che coincide con i limiti del fabbisogno giornaliero LARN. (7 mg-18 mg di ferro al giorno). Applicando la dose RDA minima raccomandata, in grado di soddisfare il fabbisogno giornaliero di ferro per età, approssimandola ad essere adeguata alla dose clinica somministrata per via orale una volta al giorno (ad es. 1,98 g ==> 2 g, 1,53 g ==> 1,5 g). Tenendo in considerazione il ferro integrato nella terapia dietetica a basso Phe, in modo da non superare la dose massima giornaliera richiesta per età e sesso secondo LARN e RDA.

Ai pazienti arruolati nel gruppo con integrazione di ferro (gruppo A) sono state fornite gratuitamente le dosi totali di 3 mesi. Il costo del Ferro tollerato dal ricercatore. Il nome commerciale dell'integratore è stato mantenuto anonimo per prevenire conflitti di interessi ed evitare qualsiasi forma di pubblicità.

Il numero di pazienti nel gruppo A (42 pazienti) che hanno consumato ferro da 1 sacca (14 mg/giorno) è stato di 26 pazienti (61,9%), di cui 18 maschi e 8 femmine, rispetto ai pazienti che hanno consumato 1 sacca in un giorno alternativo (14 mg/ogni 2 giorni) = (7 mg/die- ½ sacca/die) riguardavano 16 pazienti (38,1%) di cui 9 maschi e 7 femmine.

Analisi statistiche: i dati descrittivi sono stati riportati come media (deviazione standard [SD], mediana (intervallo interquartile [IQR] 25°-75° percentile) o numero di osservazioni e percentuale. Per valutare la distribuzione è stato utilizzato il test Shapiro Wilk. I cambiamenti longitudinali nei parametri Phe e di stress ossidativo, all'interno del gruppo, nella variabilità inter e intra soggetto sono stati testati utilizzando il test t di Student per dati appaiati e il test di Wilcoxon, quando appropriato. Sono stati eseguiti confronti univariati tra i gruppi di intervento e di controllo: per variabili continue mediante t-test di Student non appaiato o test di Mann-Whitney e/o analisi della varianza per misure ripetute; per valutare le differenze tra due gruppi per variabili continue i ricercatori hanno utilizzato il test di Mann Whitney, misura ripetuta ANOVA quando appropriato. Sono state eseguite analisi di regressione logistica binaria multipla per valutare la dipendenza di una variabile indipendente da una variabile dipendente. Il modello del test di Friedman, aggiustato per fattori di confondimento, è stato utilizzato per valutare l'effetto della supplementazione di ferro sui livelli plasmatici di Phe e per stimare il corrispondente odds ratio (OR) e il suo intervallo di confidenza al 95%. È stato considerato un livello di significatività statistica p ≤ 0,05 (test a due code). Le analisi statistiche sono state eseguite con SPSS, versione 25.0 (SPSS Inc, Chicago, IL) per Windows (Microsoft Corporation, Redmond, WA).