同種造血幹細胞移植後の免疫モニタリング

調査のエンドポイント

研究の主要なエンドポイントは、同種幹細胞移植前後のフローサイトメトリーによる循環細胞の検出です。 以下の細胞を分析します: 骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、CD16+ 樹状細胞、CD14+ 単球、CD14+/CD16+ 単球、総 T リンパ球、総 T ヘルパーリンパ球、セントラル メモリー、ナイーブ、エフェクター メモリーおよびエフェクター T ヘルパー リンパ球、総細胞傷害性細胞リンパ球、セントラル メモリー、ナイーブ、エフェクター メモリーおよびエフェクター T 細胞傷害性リンパ球、CD16+/CD56+ NK 細胞、B リンパ球、制御性 T リンパ球。

二次エンドポイントは次のとおりです。

• サイトカイン (TNFα、IFNγ、IL-4) およびケモカイン (MIP および MCP グループ) の血清濃度の測定。
• 血清中の自己抗体の測定。 第 1 段階では、抗核抗体 (ANA) および抗体抗 ENA (Extractable Nuclear Antigen) を検索することにより、スクリーニング分析が実行されます。 肯定的な結果は、第 2 レベルの分析にかけられます。 次に、肝臓抗体 (SMA、AMA、SLA)、抗カルジオリピンおよびベータ 2 ミクログロブリン抗体、甲状腺および胃壁細胞に対する抗体など、以前は慢性 GVHD に関連していたさまざまな臓器特異的自己抗体の分析に進みます。
• 単球および樹状細胞における CD86、CXCR4、CCR2、CCR5、CD11a および CD49d 分子発現の研究​​。
• 精製単球によるTNFおよびIL-12産生の研究
• 同種 CD4+ T 細胞に対する精製単球のアロ刺激活性の研究。
• 精製された単球受容体によって媒介される食作用、マクロピノサイトーシス、エンドサイトーシスによる抗原の捕捉とプロセシングの研究。
• CD134 (OX40L)、CD154 (CD40L) 分子発現の研究​​、分化分子タイプ 1 およびタイプ 2 T ヘルパー細胞および T 制御細胞関連の研究、分子細胞死関連の研究。
• マイトジェンによる刺激後のサイトカインの増殖と産生 (IL-2、IL-5、IFNγ、IL-10 を含む) およびパーフォリンとグランザイムの放出の研究。
• ELISPOT アッセイによる HY 抗原の検出のための五量体による抗原特異的 T リンパ球応答の研究。 レシピエントの細胞を採取し、移植前に保存します
• 患者の血清および細胞中のマイクロ (mi) RNA の PCR 研究。
• 移植単球の遺伝子発現プロファイルの PCR およびマイクロアレイ研究

研究デザイン

同種幹細胞移植後の in vitro 研究のためのヒト組織を用いた観察的単施設前向き研究。 この調査には遡及段階が含まれます。 この研究では、患者の末梢血サンプルを採取する必要があります。

• 部門に入ると
• 移植1ヶ月後
• 移植後3、6、9、12ヶ月

調査対象母集団

私たちの研究所で同種移植を受けているすべての患者が含まれています。

血液サンプルの収集と処理

各末梢血サンプルは、3 つのヘパリン チューブ (最大 18 ml の SP) と非抗凝固チューブ (少なくとも 3 ml の血清の合計 6 ml) で収集する必要があります。

各サンプルは次のように処理されます。

抗凝固剤なしで採取した血液サンプルを遠心分離して血清を取得し、血清のアリコートを凍結して-20°Cで保存します。前述の細胞の数と機能に関する免疫表現型分析は、収集から72時間以内に新鮮なPBサンプルで実行されます。

単核細胞と単球は、標準的な手順 (密度勾配遠心分離による MNC、免疫磁気選択による単球) によって精製され、予想される機能アッセイに使用されるまで液体窒素に保存されます。 負の CD14 画分を凍結し、T リンパ球の供給源として使用します。

フローサイトメトリー分析

免疫系循環細胞の数と表現型は、特定のモノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリーによって決定されます。以下の免疫細胞と見なされます。

• Tナイーブリンパ球（CD45RA + CCR7 +）「エフェクター」メモリーリンパ球（CD45RA-CCR7-）、「中央」メモリーリンパ球（CD45RA-CCR7 +）およびエフェクターリンパ球（CD45RA-CCR7 +）を含むCD4+およびCD8+ Tリンパ球。
• T制御性リンパ球 (CD4 + CD25 + CD127-FoxP3 +)。
• Bリンパ球 (CD19 +)
• NK 細胞 (CD56 + CD16-) および細胞傷害性 (CD56 + CD16 +) 細胞。
• 骨髄樹状細胞 CD11c + (系列-、DR +、CD33 +)、形質細胞様樹状細胞 (系列-、DR +、CD33- および CD123 +) および単球様 (CD33 +、CD14-、CD16 +) DC。
• 炎症性 (CD14 + CD16 +) および構成要素 (CD14 + CD16-) 単球

精製単球の機能研究

• TNF α および IL12 の産生は、フローサイトメトリーで測定されます。
• アロ刺激機能は、「レスポンダー」として HLA の異なる CD4 + T リンパ球を使用して混合白血球培養で決定されます。
• 抗原を捕捉する能力は、個々の細胞のフローサイトメトリーで、FITC 結合アルブミンや蛍光ビーズなどの蛍光抗原によって測定されます。
• 遺伝子発現プロファイルは、MICROARRAY study を使用して実行されます

精製Tリンパ球の機能研究

• 活性化、分化、およびアポトーシス分子の発現は、サイトメトリーによって決定されます
• サイトカイン産生は、抗 CD3 および抗 CD28 で刺激した後、単色フローサイトメトリーで測定されます。
• 女性ドナー移植を受けている陽性の男性 HLA-A2 患者では、T 型抗 HY リンパ球の頻度が、蛍光色素結合五量体によって測定されます。
• 他のすべての患者では、受容体抗原に対する T 細胞ドナーの反応を ELISPOT で測定します。

血清サイトカイン研究

血清サイトカインの濃度は、CBA (Cytokine Bead Assay、CBA、Becton Dickinson、Mountian View、CA、USA) を使用したサイトメトリーで測定されます。 以下のサイトカインを分析します。

• T ヘルパー 1 サイトカイン: TNF-α、IFN-γ、IL-12。
• T-ヘルパー 2 およびレギュレーター サイトカイン (IL-10、IL-5)、および TGF-ベータ
• ケモカイン: MCP1、MCP2、RANTES、MIP1-アルファおよび MIP1-ベータ。 IL-8、IP-10。

血清自己抗体研究

抗核抗体の濃度は、HEp2 細胞 (肝癌の細胞株) に対する間接免疫蛍光法によって測定されます。 抽出可能な核抗原 (ENA) に対する抗体は、ELISA (ENA SCREENING) によって測定されます。 陽性の場合、特定の抗原に対する抗体の存在は、DOT BLOT によって決定されます。

患者の血清および細胞におけるmicro(mi) RNA PCR研究

総 RNA は、ヒト血清サンプルから抽出され、-80 ° C で保存されます。RNA の一部 (3 μl) は、サプライヤーの説明に従って、逆転写およびプライマーのプールを使用した前増幅のために処理されます。 664 個のヒト miRNA、6 個の small human RNA、および 1 個のコントロール miRNA が並行して処理されます。

遺伝子発現プロファイル PCR および MICROARRAY による移植患者の単球の研究

単球 RNA メッセンジャーは細胞から抽出され、逆転写酵素によって cDNA に変換され、同時に蛍光プローブで標識されます。 マトリックス上に存在する核酸 (プローブ) と cDNA ターゲットとの間のハイブリダイゼーションはハイブリダイズしたままであり、それが結合している位置を検出することによって識別できます。 研究の最後に、すべてのサンプルは破棄されます。

併用療法

-患者は、現在の臨床診療に従って、移植準備のために化学療法を受けるか受けたことがある。 移植後、患者は臨床診療に従ってGVHDおよび感染症の予防のための投薬を受けます。 臨床診療に従って投与される可能性のある併用療法は、CRFに記載されています。

訪問と評価のスケジュール

-患者の訪問が予想され、登録時にCRFが完了します。 患者ごとに 6 つの血液サンプルがあります。 登録後の血液サンプルは、14 日までに遅延または予測される可能性があります

臨床検査

テストは通常​​のケア経路の下で実施され、研究固有のものではありません。 血液検査情報は CRF で報告されます。

統計分析

この試験の主要評価項目は、同種造血幹細胞移植前後の PB における循環免疫細胞数の測定値です。 統計分析は、GRAPH PAD PRISM バージョン 4.02 プログラムを使用した平均間の比較分析で構成されます。 有意水準は<.05と定義されています。副次評価項目の分析は、同じ方法を使用して実行されます。

サンプルサイズ

この研究は、同種移植を受けるすべての患者に提案されています。 Seràgnoli Institute で行われる移植の数は、年間平均 50 ～ 60 件です。 したがって、300人の患者が研究に登録されると推定されています。

行政手続き

議定書への変更は、修正の形で行われます。 研究期間中のプロトコルへの他の種類の変更は許可されていません。 研究における予期しない変更は、臨床研究報告書に記録されます。

インフォームドコンセントの管理

すべての患者は、通常のケアパスによって提供される訪問のいずれかで、インフォームドコンセントに日付を記入し、記入します。 死亡した患者のデータ処理は、一般的な承認に従って、倫理委員会による研究の承認を得て承認されていると見なされます (2012 年 3 月 26 日の公式ジャーナル 72)。

ドキュメントアーカイブ

治験責任医師は、適用される法律および GCP で要求される時間に従って、研究の完了または終了前、最中、および終了後に、研究の重要な文書を保管する責任があります。

CRF で収集されたデータは厳密に匿名であり、被験者は番号とイニシャルのみで識別されます。

治験責任医師は、患者の元のデータと書面による同意を保持する必要があります。

検査・監査

規制当局が検査を必要とする場合、治験責任医師は直ちに倫理委員会に通知する必要があります。

結果の公表

実験の結果は、結論から 12 か月以内に公開されます。