Gecontroleerde stikstofmonoxide-afgevende pleister versus meglumine-antimoon bij de behandeling van cutane leishmaniasis

ACHTERGROND

Cutane Leishmaniasis (CL) is een wereldwijde ziekte die endemisch is in 88 landen [1] . Naar schatting lijden jaarlijks 1,5 miljoen mensen aan CL en lopen meer dan 350 miljoen het risico de infectie op te lopen [2-4]. In Amerika worden jaarlijks 60.000 nieuwe gevallen van CL gemeld [5], endemisch in 20 van de 22 landen en op 2 eilanden van het Caribisch gebied [2]. Momenteel heeft CL meer dan 500 soldaten van het Amerikaanse leger getroffen die in Irak dienen [6]. In het Andesgebied is de incidentie van Leishmaniasis de afgelopen twee decennia dramatisch toegenomen; het bereiken van meer dan 14.000 gevallen per jaar van 1996-98 [7]. In Colombia zijn 6.500 gevallen gemeld [8]. De toename van de gemelde gevallen van CL in Colombia is gerelateerd aan factoren zoals migratie, ontbossing, de vermenigvuldiging van illegale plantages, het gewapende politieke conflict en de gedragsveranderingen van de vector. De belangrijkste stammen van Leishmania in Colombia zijn L. panamensis, L. brazilensis, L. infantum en L. guyanensis, die verspreid zijn over het gehele nationale grondgebied, voornamelijk in de landelijke gebieden [10]. CL wordt veroorzaakt door intracellulaire eencellige parasieten van het geslacht Leishmania [1] en wordt op de mens overgedragen door de beet van een klein percentage van de tot nu toe geclassificeerde soorten phlebotomus en lutzomyia-zandvliegen [10]. In het spijsverteringsstelsel van de zandvliegen presenteert deze dimorfe parasiet een extracellulaire flagellavorm, een promastigoot genaamd, die bij zijn vrijlating in het gastheerbloed wordt gefagocyteerd door de macrofaag, waarbij hij zijn flagella verliest en verandert in een amastigoot [12]. Honden, knaagdieren en didelphidae zijn de natuurlijke gastheren van de parasiet, terwijl de mens een incidentele gastheer is [11]. Deze zoönose heeft te maken gehad met een interessant verstedelijkingsverschijnsel, waarbij het veranderde van een vooraanstaande landelijke entiteit die voornamelijk mannen van een actieve leeftijd treft, in een ziekte die alle mensen treft, vooral kinderen [8,9]. De kenmerkende laesies van deze ziekte zijn zweren die spontaan genezen gedurende een periode van drie maanden tot een jaar, afhankelijk van het isolaat, en die een vlak, atrofisch en gedepigmenteerd litteken achterlaten [13-15]. De CL, vooral degene die wordt geproduceerd door L. brazilensis, kan evolueren naar mucocutane Leishmaniasis (MCL), die een slechtere prognose heeft vanwege het vervormende karakter van de laesies [16]. De spontane genezing van deze laesies zorgt voor de verwerving van gedeeltelijke resistentie tegen herinfectie, wat de hogere pathogeniciteit zou kunnen verklaren die wordt waargenomen bij kinderen en jongvolwassenen [9]. Eerdere studies hebben een hogere incidentie van CL en een slechte respons op behandeling bij kinderen aangetoond [17]. Het programma van epidemiologische waakzaamheid in Colombia vereist dat de waarschijnlijke gevallen van CL (geïdentificeerd door de kenmerken van de zweer en door de oorsprong van de patiënt) worden bevestigd door microscopisch direct onderzoek van een secessiemonster verkregen uit de zweer, indien deze negatief zijn, door biopsie van de wond . Eenmaal bevestigd, moeten de gevallen aan de lokale gezondheidssecretaris worden gemeld met behulp van klinisch-epidemiologische gegevens. Deze instelling, belast met de epidemiologische waakzaamheid, bestudeert de bronnen van overdracht en deelt de medicatie uit aan de getroffen personen. Momenteel worden verschillende aspecten overwogen bij de behandeling van CL, waarvan het risico op het ontwikkelen van MCL, de graad, lokalisatie, het aantal, de grootte, de evolutie en de persistentie van de laesies de belangrijkste zijn [18]. Al meer dan 60 jaar worden de vijfwaardige antimoonverbindingen: natriumstibogluconaat, (Pentostan®, geproduceerd door Glaxo-Wellcome) en meglumine-antimoniaat, (Glucantime®, geproduceerd door Sanofi-Aventis) beschouwd als de voorkeursbehandelingen voor deze ziekte [19 ]. Studies uitgevoerd in Colombia rapporteerden een genezingspercentage van 85% met behulp van meglumine-antimoniaat [20,21]. Ondanks het feit dat de werkzaamheid van deze geneesmiddelen hoog is, vertonen ze veel nadelen, zoals parenterale toediening en omkeerbare secundaire effecten zoals misselijkheid, braken, spier- en buikpijn, hartproblemen, een stijging van de concentratie van hepatische aminotransferasen en chemische pancreatitis [21,22]. Bovendien wordt de therapietrouw beïnvloed door de duur (meerdere weken) en de beschikbaarheid ervan door de beperking van de distributie. Therapeutische alternatieven van de tweede lijn zijn voorgesteld; amfotericine B en pentamidine zijn gebruikt met uitstekende resultaten, niettemin hebben hun hoge kosten, geringe beschikbaarheid, de noodzaak om de patiënten voor hun toediening in het ziekenhuis op te nemen en de ernst van hun secundaire effecten hun gebruik beperkt [23,24]. In de afgelopen tien jaar zijn er nieuwe behandelingen voor CL ontwikkeld, waarbij gebruik is gemaakt van orale middelen zoals mefloquine, itraconazol, miltefosine, paromomycine, ketoconazol, allopurinol en dapson, maar deze hebben onvoldoende bewijs geleverd voor hun effectiviteit [19,21,25,26 ]. In een poging om een ​​topische behandeling voor CL te ontwikkelen, is paromomycine in verschillende preparaten gebruikt. De genezingspercentages die met dit medicijn zijn bereikt, waren echter niet hoger dan bij conventionele behandelingen, zelfs niet in vergelijking met placebo [27,28]. In verschillende studies, in vitro en in vivo, is aangetoond dat stikstofmonoxide (NO) effectief is om verschillende stammen van Leishmania in zijn amastigote vorm te elimineren [29-35]. De productie van NO uit de oxidatie van L-arginine veroorzaakt door de induceerbare stikstofoxidesynthase (iNOS) vormt een van de belangrijkste afweermechanismen van de macrofagen [36], waarin twee oxidatieve vormen van afweer tegen Leishmania zijn geïdentificeerd. Tijdens de eerste fase van infectie, als reactie op het fagocytoseproces, worden sommige promastigoten geëlimineerd door het vrijkomen van het superoxide-ion, een proces dat wordt gekatalyseerd door de NADPH-oxidase [29]. Die promastigoten die dit verdedigingsmechanisme overleven, evolueren naar amastigoten, die de productie van IL-12 in de macrofagen activeren en de presentatie van de antigenen van Leishmania [29] aan de T-helpers 1-lymfocyten bevorderen die de cytotoxische activiteiten van de macrofagen naar de intracellulaire parasieten via het interferon-gamma (INFγ) en de tumornecrosefactor-alfa (TNFα) door de productie van NO gekatalyseerd door iNOS te bevorderen [31-33]. Een recente studie toont een hogere activiteit van iNOS in de macrofagen van met CL geïnfecteerde proefpersonen, wat een vitale rol van NO in de immunologische activiteit tegen Leishmania suggereert [34]. In onderzoeken met knaagdieren die resistent waren tegen Leishmania-infectie (C57BL/6), waarbij L. major, L. chagasi of L. donovani werden geïnoculeerd, veroorzaakte de toepassing van iNOS-remmers zoals NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) een hoger overlevingspercentage en virulentie van de parasieten in macrofagen [33,35,37,38]. Na inoculatie van L. major bij muizen met de genetische gevoeligheid om infecties met Leishmania (BALB/C) te ontwikkelen, werd geen activiteit van iNOS waargenomen. De toepassing van IL-12 kon de infectie echter beheersen door iNOS te activeren [31]. Bij mensen zijn verschillende klinische onderzoeken uitgevoerd met topische behandelingen die GEEN donoren bevatten [39,40]. In Ecuador ontwikkelde en testte onze groep een NO-genererende actuele crème met S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), wat een gunstig effect aantoonde bij de behandeling van dit type ulcera zonder meldingen van enige ernstige bijwerking. Desalniettemin moest de crème vanwege de onstabiele afgifte van stikstofmonoxide vaak worden aangebracht (4 keer per dag), waardoor het moeilijk was om de behandeling vol te houden [39]. In Syrië gebruikte een andere groep kaliumnitraat aangezuurd met salicylzuur en ascorbinezuur voor de topische behandeling van L. tropica [40]. In vitro vernietigde dit NO-genererende mengsel de amastigoten en promastigoten van Leishmania; in vivo leverde de studie van 40 patiënten echter inconsistente resultaten op, waarbij de omvang van de zweer bij 28% van de proefpersonen werd verminderd en slechts 12% genas. Aangenomen wordt dat de discrepantie in deze resultaten te wijten is aan de techniek die is gebruikt om de NO te verkrijgen. De verzuring van nitriet produceert een onmiddellijke explosie van NO, maar de afgifte ervan wordt niet gedurende een lange periode gehandhaafd [40]. De moeilijkheid om de vrijmaking van NO te beheersen, heeft de noodzaak gecreëerd om naar nieuwe technieken te zoeken om de vrijlating ervan te reguleren. De nanovezelpolymeren geproduceerd door de elektrospintechniek zijn bestudeerd om de constante afgifte van geneesmiddelen op de laesie te garanderen. Bij het elektrospinproces wordt een hoog voltage gebruikt om een ​​elektrisch geladen straal polymeeroplossing te creëren, die droogt en stolt om een ​​droge polymeervezel achter te laten [41]. Terwijl deze straal door de lucht beweegt, verdampt het oplosmiddel en blijft een geladen vezel achter die elektrisch kan worden afgebogen en verzameld op een metalen scherm [42,43]. Vezels met verschillende dwarsdoorsnedevormen en -afmetingen worden geproduceerd uit verschillende polymeren. Met deze techniek is het inkapselen of insluiten van verschillende geneesmiddelen, enzymen en eiwitten succesvol geweest. In een eerdere studie werden nanovezelpleisters met succes gebruikt als dragers van tetracyclinehydrochloride. De afgifte van tetracycline was gedurende 5 dagen constant [41;43]. Met hetzelfde model is een meerlagige transdermale pleister geproduceerd, waarin nitriet is gebonden aan een ionenuitwisselingshars (DOWEX) en elektrogesponnen is tot een laag van polyurethaan nanovezels. Een oplossing die Waterlock® superabsorberend middel en polyurethaan bevat, wordt elektrogesponnen bovenop de nitriet-DOWEX-laag. Het ascorbinezuur dat in de polyurethaanoplossing zit, wordt elektrogesponnen op een derde laag, met nog een laag Waterlock® superabsorberend middel en polyurethaan als vierde en laatste laag. Na hydratatie produceert deze stikstofmonoxide-afgevende patch (NOP) een stabiele afgifte van 3,5 µmol NO gedurende 12 uur [41,44,45]. In een pilootstudie, ontwikkeld in Landazuri, Santander, Colombia, werd een placebogecontroleerde klinische studie uitgevoerd met 35 patiënten die 68 zweren vertoonden veroorzaakt door L. panamensis.Met behulp van de NOP werd een verbetering van 65% waargenomen in de behandelde zweren, met slechts een verbetering van 25% in de placebogroep (p=0,001). In deze pilotstudie was de enige beschreven bijwerking jeuk in het gebied waar de pleister was aangebracht (niet-gepubliceerde gegevens). Rekening houdend met de brede verspreiding van CL, de veranderingen in de vorm van transmissie en de moeilijkheid in verband met de beschikbaarheid van medicatie, stelt deze studie voor om te onderzoeken of de NO-donortransdermale pleister, geproduceerd door elektrospinning, minstens even effectief is als de meglumine-antimoniaat voor de behandeling van CL, met minder bijwerkingen en lagere kosten, en vormt daarom een ​​effectief therapeutisch alternatief. Als de effectiviteit van de NOP in deze studie wordt aangetoond, zal een nieuw en veilig therapeutisch alternatief met gemakkelijke toegang en hogere therapietrouw voor een van de belangrijkste volksgezondheidsproblemen in ons land beschikbaar worden gesteld.

DOELSTELLINGEN

Algemene doelstelling

Om de effectiviteit en veiligheid van NOP bij de behandeling van CL te evalueren in vergelijking met meglumine-antimoniaat (Glucantime®).

Specifieke doelen

1. Om de genezingssnelheid van CL-zweren te evalueren met behulp van een NOP in vergelijking met het behandelingsplan met meglumine-antimoniaat aanbevolen door het ministerie van Volksgezondheid.
2. Om bijwerkingen te identificeren die verband houden met de toepassing van NOP en deze te vergelijken met de bijwerkingen die worden veroorzaakt door de behandeling met meglumine-antimoniaat.
3. In kaart brengen en vergelijken van de recidive die kan optreden bij zowel NOP als meglumine-antimoniaat.
4. Vooruitgang in het zoeken naar een therapeutisch alternatief voor CL in Colombia.

ONTWERP

Dubbelblinde, gerandomiseerde, dubbelblinde, placebogecontroleerde klinische studie, waarin stikstofmonoxide-afgevende pleisters werden vergeleken met meglumine-antimoniaat.

STEEKPROEFGROOTTE

Het monster werd berekend volgens de arccosinusformule met een vermogen van 80% en een type 1-fout van 0,05%. Bij een succespercentage van 85% voor meglumine-antimoniaat en 75% voor NOP zijn er 558 patiënten nodig. Na correctie voor een uitvalpercentage van 5% is het totaal aantal patiënten dat moet worden geworven 620 (310 patiënten per behandelingsgroep).

BEVOLKING

De bevolking zal worden samengesteld uit twee regio's van Colombia. De eerste is een endemische zone in Santander, Colombia, gelegen tussen de Magdalena-vallei en de East Mountain Range, die de gemeenten Landazuri, El Carmen, San Vicente, El Playon en Rionegro omvat. De tweede regio is een endemische zone in Noord-Tolima, die de gemeenten Chaparral, San Antonio, Libano, Falan, Palocabildo en Mariquita omvat.

SELECTIE VAN DE PATIËNTEN

Inclusiecriteria

1. Mannen en vrouwen tussen de 18 en 50 jaar
2. Huidzweren van meer dan twee weken evolutie
3. Positieve parasitologische diagnose voor CL
4. Patiënten die vrijwillig akkoord gaan met deelname aan het onderzoek en de geïnformeerde toestemming ondertekenen.
5. Bereidheid om alle bezoeken stipt bij te wonen (aanvankelijk, behandeling en follow-up)
6. Acceptatie van het niet gebruiken van een andere behandeling voor CL tijdens het onderzoek

Uitsluitingscriteria

1. Zwangere vrouw
2. Aanwezigheid van een aandoening of ziekte die de patiënt immunologisch in gevaar brengt (d.w.z. diabetes, kanker, enz.) of enige andere die, op basis van het oordeel van de onderzoeker, het verloop van CL zou kunnen veranderen.
3. Diffuus CL of meer dan vijf actieve laesies.
4. Mucocutane leishmaniasis (geen enkele laesie mag zich op minder dan 2 cm van de neus-, urogenitale en/of anale slijmvliezen of van de rand van de lippen bevinden).
5. Viscerale leishmaniasis
6. Volledige of onvolledige behandeling met antimoonverbindingen in de laatste drie maanden.
7. Patiënten met een voorgeschiedenis van lever-, nier- of cardiovasculaire aandoeningen.
8. Mentaal of neurologisch gehandicapte patiënten die niet geschikt worden geacht om hun deelname aan het onderzoek goed te keuren.

STUDIE ONTWIKKELING

Logistieke fase

Deze fase duurt 4 maanden en omvat de volgende werkzaamheden:

1. Training van het personeel dat zal deelnemen aan het onderzoek.
2. Aankoop van de materialen die nodig zijn voor de ontwikkeling van het project.
3. Uitwerken van flyers, promotie- en educatief materiaal, procedurehandleiding en case report-formulieren (CRF's).
4. Randomisatie van de behandeling. De randomisatie van de behandeling zal worden gerealiseerd door de epidemioloog van de Cardiovasculaire Stichting van Colombia. Deze randomisering gebeurt in blokken om de grootte van de behandelingsgroepen gelijk te houden, om lange reeksen van dezelfde behandeling te vermijden en om waar mogelijk een deel van de vertekening die inherent is aan het eenvoudige randomisatieproces in evenwicht te brengen. Daarnaast zal deze randomisatie in blokken het uitvoeren van tussentijdse analyses vergemakkelijken.

Wervingsfase

Deze fase duurt 22 maanden. In de geselecteerde gemeenten zal het gezondheidspersoneel dat werkzaam is in ziekenhuizen en gezondheidscentra een opleiding krijgen over de ziekte en de onderzoeksmethodiek. Tegelijkertijd zal een epidemiologische focusstudie worden uitgevoerd met de leiders van de gemeenschap en het gezondheidspersoneel om de geografische en demografische omstandigheden te identificeren met als doel strategieën te ontwikkelen voor de rekrutering van mogelijke gevallen van leishmaniasis. Vervolgens zullen de proefpersonen die actieve ulcera vertonen met een evolutie van meer dan 2 weken, met of zonder parasitologische bevestiging van CL, door de gezondheidspromotors worden uitgenodigd om het screeningsbezoek bij te wonen (Tabel 1).

Screeningsbezoek

Tijdens dit bezoek zal een volledige klinische geschiedenis worden uitgewerkt en gegevens over antecedenten van leishmaniasis worden verkregen (toegediende behandeling, lokalisatie, aantal laesies, enz.). Er zal een volledige medische evaluatie worden gerealiseerd op basis van universeel aanvaarde technieken. De in- en uitsluitingscriteria worden toegepast en de geselecteerde kandidaten worden geïnformeerd over het onderzoek, waarna ze een geïnformeerde toestemming ondertekenen. Voor die proefpersonen met zweren van meer dan twee weken evolutie zonder parasitologische diagnose zal een directe test worden uitgevoerd door de parasitoloog. Als de eerste directe test negatief is, wordt deze maximaal drie keer herhaald; waarna bij negatieve uitslag een biopsie wordt uitgevoerd. Als leishmaniasis niet wordt bevestigd, wordt de patiënt teruggestuurd naar het oorspronkelijke gezondheidscentrum.

Eerste bezoek

De geïncludeerde patiënten worden willekeurig toegewezen aan een van de twee groepen. Er wordt een kweek in Novy-Nicole-McNeal (NNN)-medium genomen voor identificatie van de stam en er wordt een bloedmonster uit de antecubitale ader genomen voor bepaling van leverenzymen, creatinine en pancreasamylase. Tijdens dit bezoek wordt een volledige medische evaluatie uitgevoerd, wordt de zweer gemeten en wordt er een foto gemaakt. Voordat de foto wordt gemaakt, wordt naast de zweer een schaalverdeling geplaatst, samen met een sticker met daarop de identificatiecode van de deelnemer en de datum van het bezoek. De eerste NOP (actief of placebo) wordt op de laesie aangebracht en de eerste dosis meglumine-antimoniaat (actief of placebo) wordt toegediend. De patiënten krijgen informatie over hoe ze de pleisters niet mogen beschadigen en hoe ze ongewenste voorvallen kunnen identificeren en melden. Om de patiënten daarbij te helpen, krijgen ze een dagboek om ze te registreren. De twee willekeurig samengestelde groepen worden als volgt verdeeld:

Groep 1: Gedurende 20 dagen krijgt deze groep gelijktijdig intramusculair (IM) meglumine-antimoniaat (Glucantime® 20 mg/kg/dag met een maximale dosis van 3 ampullen per dag); en een NOP-placebo.

Groep 2: Gedurende 20 dagen krijgt deze groep gelijktijdig een placebo van IM meglumine antimoniaat (5-15cc/dag) en een actieve NOP.

Behandelbezoeken

De patiënten zullen gedurende 20 dagen dagelijks het gezondheidscentrum bezoeken om zowel het NOP (placebo of actief) als meglumine-antimoniaat (placebo of actief) te ontvangen. Dagelijks worden de proefpersonen en hun therapietrouw beoordeeld en worden de gegevens verzameld. Als er een bijwerking wordt vastgesteld, wordt de patiënt onmiddellijk doorverwezen naar de medische staf die een evaluatie zal maken en dit zal rapporteren aan de commissie voor ongewenste voorvallen die in elk geval de uiteindelijke beslissing zal nemen.

Vervolgbezoeken

Deze fase duurt 10 maanden. Tijdens de follow-up worden de patiënten op 4 momenten door de onderzoeksgroep gezien. Het eerste bezoek vindt plaats op de dag na het einde van de behandeling (dag 21) waarbij nieuwe bloedmonsters worden genomen voor biochemische bepalingen. Het tweede, derde en vierde bezoek worden respectievelijk op dag 45, 90 en 180 gerealiseerd. Tijdens deze bezoeken wordt het genezingsproces van de zweer, de aanwezigheid van recidive en/of herinfectie en de gezondheid van de deelnemers beoordeeld. De evolutie van de zweren zal fotografisch worden geregistreerd.

De maximale en minimale diameter van de zweer wordt gemeten met behulp van een liniaal met schaalverdeling en de verharding met behulp van de balpentechniek. De ulcus- en verhardingsgebieden worden apart berekend en geregistreerd in het CRF. De evaluatie van de klinische respons zal gebaseerd zijn op de zweer die de minste verbetering vertoont.

1. Volledige klinische respons: Volledige re-epithelisatie van de zweer en verdwijning van de verharding.
2. Klinische verbetering: vermindering van meer dan 50% van de zweer en de verhardingsgebieden in vergelijking met de laatste klinische evaluatie.
3. Afwezigheid van klinische respons: Toename of afname van minder dan 50% van de zweer en de verhardingsgebieden ten opzichte van de laatste klinische evaluatie.

4. Therapeutisch falen:

   1. Toename van de omvang van de zweer met meer dan 50% ten opzichte van de laatste klinische evaluatie
   2. Aanwezigheid van de zweer drie maanden na het begin van de behandeling.
   3. Reactivering: Verschijnen van een laesie aan de rand of in het midden van het litteken, met positieve parasitologische diagnose, na een periode van volledige re-epithelisatie.
   4. Aandoening van de slijmvliezen: Aanwezigheid van aandoeningen van de slijmvliezen tijdens de behandeling, aan het einde ervan of bij de vervolgbezoeken.
5. Reïnfectie: Activering van een zweer in een ander gebied dan de oorspronkelijke laesie.

Voor proefpersonen van wie de behandeling als een mislukking wordt beschouwd, wordt de code verbroken en worden ze teruggestuurd naar hun oorspronkelijke gezondheidscentrum om te zoeken naar een andere therapeutische benadering.

Procedures

Fysiek onderzoek

Er wordt een volledig lichamelijk onderzoek uitgevoerd en de vitale functies worden gemeten.

Bloedmonsters ingetrokken

Er zullen bloedmonsters uit de antecubitale ader worden genomen om de volgende biochemische analyses uit te voeren:

1. Creatinine door spectrofotometrie
2. Alanine transaminase (ALT) door spectrofotometrie
3. Aspartaattransaminase (AST) door spectrofotometrie
4. Pancreasamylase door spectrofotometrie

Bemonsteringstechniek voor de directe test van CL

Er wordt een directe test uitgevoerd om de aanwezigheid van cellen met amastigoten in een dermisschraapsel te bevestigen [46,47]; het monster moet, voor zover mogelijk, vrij zijn van bloed, celafval of pus. Als de patiënt meerdere laesies vertoont, moet het monster worden genomen van het monster met de kortste evolutietijd, het grootste verhardingsgebied en/of de minste etterende afscheiding. Als de laesie een korstje heeft, moet deze worden verwijderd om de kwaliteit van het monster te verbeteren. Het monster kan van de actieve rand of van de onderkant van de zweer worden genomen. Wanneer het monster van de actieve rand wordt genomen, moet asepsis worden gerealiseerd met alcohol van 70% en vervolgens moet hemostase worden uitgevoerd met de wijsvinger en tweede vinger om er zeker van te zijn dat er geen bloed in het monster zit. Er wordt een kleine incisie van ongeveer 3 mm lang en diep gemaakt met een scalpel in de actieve rand parallel aan de rand van de zweer. Met de scherpe kant van het scalpel wordt in de huidwand van de incisie geschraapt om weefsel te verkrijgen. Het geëxtraheerde materiaal wordt uitgebreid op twee objectglaasjes. Het monster wordt bij kamertemperatuur gedroogd en vervolgens gefixeerd met methanol en gekleurd met Giemsa, Wright of Field. Met immersie-olie wordt het monster geobserveerd onder een microscoop met een 100X lens, de aanwezigheid van amastigoten van Leishmania beoordeeld en hun structuur geverifieerd (kern, kinetoplast en celmembraan). Als het monster uit het midden van de laesie wordt genomen, moet dezelfde hemostatische techniek worden gebruikt, moet de korst worden verwijderd en moet de bodem van de zweer goed worden schoongemaakt met de scherpe kant van de scalpel om de aanwezigheid van cellulair afval en/of etterend materiaal te voorkomen . Deze procedure moet worden voortgezet totdat de granulomen onderaan zichtbaar zijn. Met dezelfde techniek die wordt gebruikt om de monsters van de actieve rand te verwerken, wordt de aanwezigheid van amastigoten van Leishmania geverifieerd.

Techniek voor het bemonsteren van culturen

Het monster voor de kweek kan worden verkregen door de actieve rand van de zweer af te zuigen of door een weefselfragment te extraheren dat vervolgens wordt gemacereerd in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met antibiotica (1000 IE kristallijne penicilline per cc), voordat het wordt verwijderd. in het kweekmedium doen. Bij de afzuigtechniek wordt een tuberculinespuit met een dunne naald (26G) gebruikt die 0,3 cc PBS-oplossing met antibiotica bevat. Voorafgaande asepsis van de zweer met alcohol van 70%, een naald wordt in de dermis gebracht en door middel van roterende bewegingen wordt een kleine hoeveelheid weefsel gedurende ongeveer een minuut door de schuine kant van de naald gemacereerd, waarna het in de injectiespuit wordt gezogen. Het monster wordt onder aseptische omstandigheden in een NNN-kweekmedium geplaatst en gedurende 4 weken bij 26ºC geïncubeerd [46,47]. Elke week wordt een druppel uit het kweekmedium gehaald en tussen twee objectglaasjes geplaatst om onder een microscoop te worden bekeken. In het geval dat er geen promastigoten worden gevonden, worden de kweken als negatief afgewezen [46]. De stammen worden per soort geïdentificeerd met behulp van de monoklonale antilichamen ontwikkeld door Dr. Diane Mc Mahon Pratt [48,49].

Evaluatie en beheer van bijwerkingen

Tijdens de behandeling en de vervolgbezoeken zullen de patiënten worden gevraagd naar bijwerkingen. Elke bijwerking wordt door de arts geclassificeerd als ernstig of niet-ernstig (tabel 2 en 3). Een ernstig ongewenst voorval moet aan een of meer van de volgende criteria voldoen:

1. Dood
2. Levensbedreigend (d.w.z. onmiddellijk risico op overlijden)
3. Ziekenhuisopname of verlenging van bestaande ziekenhuisopname
4. Aanhoudende of significante invaliditeit/onbekwaamheid De aanwezigheid van een ernstige bijwerking die het leven van de patiënt in gevaar brengt en/of onmiddellijke medische of chirurgische ingrepen vereist, vereist stopzetting van de behandeling en het starten van de relevante medische behandeling van de patiënten. De onderzoeker zal de Adverse Event Committee (AEC) van de FCV binnen 24 uur na kennisname van elke ernstige bijwerking op de hoogte stellen.

Een niet-ernstig ongewenst voorval wordt als volgt geclassificeerd:

1. Mild: de patiënten zijn zich bewust van hun symptomen en/of tekenen, maar die zijn draaglijk. Ze vereisen geen medische tussenkomst of specifieke behandeling.
2. Matig: Patiënten vertonen problemen die hun dagelijkse activiteiten verstoren. Ze vereisen medische tussenkomst of specifieke behandeling.
3. Ernstig: de patiënten zijn niet in staat om te werken of hun dagelijkse bezigheden bij te wonen. Ze vereisen medische tussenkomst of specifieke behandeling.

De mogelijke relatie tussen de bijwerkingen en de geteste medicatie wordt door de onderzoeker geclassificeerd op basis van zijn/haar klinisch oordeel en de volgende definities:

1. Absoluut gerelateerd: Gebeurtenis kan volledig worden verklaard door de toediening van de geteste medicatie.
2. Waarschijnlijk gerelateerd: het voorval wordt hoogstwaarschijnlijk verklaard door de toediening van de geteste medicatie in plaats van door andere medicatie of door de klinische toestand van de patiënt.
3. Mogelijk gerelateerd: Voorval kan worden verklaard door de toediening van de geteste medicatie of andere medicatie of door de klinische toestand van de patiënt.
4. Niet gerelateerd: het voorval wordt hoogstwaarschijnlijk verklaard door de klinische toestand van de patiënt of andere medicijnen, in plaats van door de geteste medicatie.

Alle gebeurtenissen worden gerapporteerd aan de AEC die, afhankelijk van hun criteria, zal beslissen over de continuïteit of de terugtrekking van de patiënt uit het onderzoek en dus het breken van de code.

Hoewel het project is opgezet om de inherente risico's tot een minimum te beperken, zullen alle bijwerkingen die verband houden met de studiemedicatie zorgvuldig worden geëvalueerd door de AEC en zullen de kosten die worden gegenereerd door de vereiste behandeling worden gedekt door de studie.

Fase van data-analyse

Deze fase duurt 6 maanden. Nadat alle gegevens zijn ingevoerd in de CFR, worden de resultaten gecontroleerd en worden de gedetecteerde fouten geëvalueerd en gecorrigeerd door de verantwoordelijke persoon. De informatie wordt door twee verschillende mensen in twee verschillende databases ingevoerd en de records worden vergeleken om eventuele discrepanties op te sporen. De originele CFR zal worden gebruikt om eventuele fouten in de database te corrigeren.

Voor de statistische analyse wordt Stata 8.0 gebruikt. De beschrijvende analyse zal worden samengesteld uit medianen en proporties volgens de aard van de variabelen, met respectieve betrouwbaarheidsintervallen van 95%. Als dispersiemeting wordt de standaarddeviatie berekend. De verdeling van de variabelen wordt bestudeerd met behulp van de Shapiro-Wilk-test. Om enig verschil tussen de groepen te detecteren, wordt een T-test of een Wilcoxon-test uitgevoerd volgens de verdeling ervan. De categorische variabelen worden vergeleken met behulp van de Chi2-test of de exacte Fisher's-test. Indien nodig wordt een model van meerdere logistische regressies of een covariantieanalyse uitgevoerd.

Bij 35% en 70% van het berekende monster worden twee tussentijdse analyses uitgevoerd met als doel de verschillen in effectiviteit en veiligheid tussen de behandelingen vast te stellen.

Eindpunten

Aan het einde van de studie zullen twee eindpunten worden geëvalueerd:

1. Succesvolle behandeling:

   1. Voltooi re-epithelisatie drie maanden na het begin van de behandeling.
   2. Afwezigheid van reactivering en aandoeningen van de slijmvliezen gedurende de 6 maanden van de studie.

2. Mislukking van de behandeling:

   1. Onvolledige re-epithelisatie drie maanden na het begin van de behandeling.
   2. Toename van de omvang van de zweer met meer dan 50% ten opzichte van de laatste klinische evaluatie
   3. Reactivering en/of aandoeningen van de slijmvliezen tijdens de 6 maanden van de studie.

Laatste rapport

Aan het einde van de studie zullen de resultaten worden geëvalueerd en besproken en zal een eindrapport worden gepresenteerd aan COLCIENCIAS, de entiteit die het project sponsort. De relevante resultaten zullen worden gepubliceerd in zowel nationale als internationale tijdschriften en worden gepresenteerd op congressen en wetenschappelijke bijeenkomsten.

ETHISCHE ASPECTEN

Deze studie zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en met de Colombiaanse wetgeving volgens Resolutie 8430/93 van het Ministerie van Volksgezondheid. Voorafgaand aan de opname van de patiënten in de studie, zullen de doelstellingen en de methodologie worden toegelicht en de geïnformeerde toestemming wordt verkregen. De studie werd goedgekeurd door de Research Ethic Committee van de Cardiovascular Foundation of Colombia (Wet nr. 105/28 januari 2005). Het recht op vertrouwelijkheid van de patiënten zal in alle fasen van de studie worden gehandhaafd.

CONCURRERENDE BELANGEN

Niet-financiële concurrerende belangen

De auteurs van dit manuscript verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben, inclusief politieke, persoonlijke, religieuze, ideologische, academische, intellectuele of andere concurrerende belangen.

Financiële concurrerende belangen

We hebben in de afgelopen vijf jaar geen vergoedingen, vergoedingen, financiering of salaris ontvangen van enige organisatie die op enigerlei wijze zou kunnen profiteren of verliezen van de publicatie van dit manuscript, nu of in de toekomst. We hebben geen aandelen of aandelen in een organisatie die op enigerlei wijze financieel kan winnen of verliezen door de publicatie van het manuscript, nu of in de toekomst. We hebben geen patenten of vragen deze momenteel aan met betrekking tot de inhoud van het manuscript. We hebben geen vergoedingen, vergoedingen, financiering of salaris ontvangen van een organisatie die patenten bezit of heeft aangevraagd met betrekking tot de inhoud van het manuscript.