Kontrolowany plaster uwalniający tlenek azotu w porównaniu z antymonianem megluminy w leczeniu leiszmaniozy skórnej

TŁO

Leiszmanioza skórna (CL) jest chorobą ogólnoświatową, która występuje endemicznie w 88 krajach [1]. Szacuje się, że rocznie na CL choruje 1,5 miliona osób, a ponad 350 milionów jest zagrożonych zakażeniem [2-4]. W Ameryce co roku zgłaszanych jest 60 000 nowych przypadków CL [5], które są endemiczne w 20 z 22 krajów i na 2 wyspach Karaibów [2]. Obecnie CL dotyczy ponad 500 żołnierzy US Army służących w Iraku [6]. W regionie andyjskim częstość występowania leiszmaniozy dramatycznie wzrosła w ciągu ostatnich dwóch dekad; osiągając ponad 14 000 przypadków rocznie w latach 1996-98 [7]. W Kolumbii zgłoszono 6500 przypadków [8]. Wzrost zgłoszonych przypadków CL w Kolumbii był związany z czynnikami takimi jak migracja, wylesianie, rozmnażanie nielegalnych plantacji, zbrojny konflikt polityczny i zmiany behawioralne wektora. Głównymi szczepami Leishmania w Kolumbii są L. panamensis, L. brazilensis, L. infantum i L. guyanensis, które występują na całym terytorium kraju, głównie na obszarach wiejskich [10]. CL jest wywoływana przez wewnątrzkomórkowe pierwotniaki pasożytnicze z rodzaju Leishmania [1] i jest przenoszona na człowieka poprzez ukąszenia niewielkiego odsetka dotychczas sklasyfikowanych gatunków ćmiankowatych i lutzomyia [10]. W układzie pokarmowym much piaskowych ten dimorficzny pasożyt prezentuje zewnątrzkomórkową wiciową formę zwaną promastigotem, który po uwolnieniu do krwi żywiciela jest fagocytowany przez makrofaga, tracąc wici i zamieniając się w amastigota [12]. Naturalnymi żywicielami pasożyta są psy, gryzonie i didelphidae, natomiast żywicielem incydentalnym jest człowiek [11]. Ta choroba odzwierzęca uległa interesującemu zjawisku urbanizacyjnemu, zmieniając się z wybitnej jednostki wiejskiej, dotykającej głównie mężczyzn w wieku aktywnym, w chorobę dotykającą wszystkich ludzi, a zwłaszcza dzieci [8,9]. Charakterystycznymi zmianami chorobowymi tej choroby są owrzodzenia gojące się samoistnie w okresie od trzech miesięcy do roku, w zależności od izolatu, pozostawiające płaską, zanikową i odbarwioną bliznę [13-15]. CL, zwłaszcza ten wytwarzany przez L. brazilensis, może ewoluować w leiszmaniozę śluzówkowo-skórną (MCL), która ze względu na deformujący charakter zmian ma gorsze rokowanie [16]. Samoistne wyleczenie tych zmian pozwala na nabycie częściowej oporności na reinfekcję, co może tłumaczyć wyższą patogeniczność obserwowaną w populacji dzieci i młodych dorosłych [9]. Wcześniejsze badania wykazały większą częstość CL i słabą odpowiedź na leczenie w populacji dzieci [17]. Program nadzoru epidemiologicznego w Kolumbii wymaga, aby prawdopodobne przypadki CL (określane na podstawie cech owrzodzenia i pochodzenia pacjenta) były potwierdzane przez bezpośrednie badanie mikroskopowe próbki secesji pobranej z owrzodzenia, jeśli są one ujemne, przez biopsję rany . Po potwierdzeniu przypadki należy zgłosić lokalnemu sekretarzowi ds. zdrowia, korzystając z dokumentacji kliniczno-epidemiologicznej. Instytucja ta, odpowiedzialna za nadzór epidemiologiczny, bada źródła przenoszenia i dystrybuuje leki do osób dotkniętych chorobą. Obecnie w leczeniu CL uwzględnia się różne aspekty, wśród których najważniejsze są ryzyko rozwoju MCL, stopień, lokalizacja, liczba, wielkość, ewolucja i utrzymywanie się zmian [18]. Od ponad 60 lat pięciowartościowe związki antymonu: stiboglukonian sodu (Pentostan®, produkowany przez Glaxo-Wellcome) i antymonian megluminy (Glucantime®, produkowany przez Sanofi-Aventis) są uważane za leki z wyboru w tej chorobie [19]. ]. Badania przeprowadzone w Kolumbii wykazały odsetek wyleczeń wynoszący 85% przy użyciu antymonianu megluminy [20,21]. Pomimo wysokiej skuteczności tych leków, mają one wiele wad, takich jak podawanie pozajelitowe oraz odwracalne skutki uboczne, takie jak nudności, wymioty, bóle mięśni i brzucha, problemy z sercem, wzrost stężenia aminotransferaz wątrobowych oraz chemiczne zapalenie trzustki [21,22]. Dodatkowo na przestrzeganie kuracji wpływa czas jej trwania (kilka tygodni), a na dostępność ograniczenie w jej dystrybucji. Zaproponowano alternatywy terapeutyczne drugiego rzutu; Amfoterycyna B i pentamidyna były stosowane z doskonałymi wynikami, jednak ich wysoki koszt, mała dostępność, konieczność hospitalizacji pacjentów w celu ich podania oraz nasilenie ich skutków wtórnych ograniczają ich zastosowanie [23,24]. W ostatniej dekadzie opracowano nowe metody leczenia CL, wykorzystujące środki doustne, takie jak meflochina, itrakonazol, miltefozyna, paromomycyna, ketokonazol, allopurynol i dapson, jednak nie wykazały one wystarczających dowodów na ich skuteczność [19,21,25,26]. ]. W celu opracowania miejscowego leczenia CL, paromomycynę stosowano w różnych preparatach. Jednak wskaźniki wyleczenia osiągnięte dzięki temu lekowi nie były wyższe niż w przypadku leczenia konwencjonalnego, nawet w porównaniu z placebo [27,28]. W kilku badaniach in vitro i in vivo wykazano, że tlenek azotu (NO) skutecznie eliminuje różne szczepy Leishmania w postaci amastigota [29-35]. Produkcja NO z utleniania L-argininy przez indukowalną syntazę tlenku azotu (iNOS) stanowi jeden z najważniejszych mechanizmów obronnych makrofagów [36], w którym zidentyfikowano dwie oksydacyjne formy obrony przed Leishmania. W pierwszej fazie infekcji, w odpowiedzi na proces fagocytozy, część promastigotów jest eliminowana w wyniku uwolnienia jonu ponadtlenkowego, co jest katalizowane przez oksydazę NADPH [29]. Te promastigoty, które przetrwają ten mechanizm obronny, ewoluują w amastigoty, aktywując produkcję IL-12 w makrofagach i promując prezentację antygenów Leishmania [29] limfocytom T pomocniczym 1, które wzmacniają aktywność cytotoksyczną makrofagów w kierunku wewnątrzkomórkowego pasożytów poprzez interferon gamma (INFγ) i czynnik martwicy nowotworów alfa (TNFα) poprzez promowanie produkcji NO katalizowanej przez iNOS [31-33]. Niedawne badanie wykazało wyższą aktywność iNOS w makrofagach osób zakażonych CL, co sugeruje istotną rolę NO w aktywności immunologicznej przeciwko Leishmania [34]. W badaniach gryzoni opornych na infekcję Leishmania (C57BL/6), którym szczepiono L. major, L. chagasi lub L. donovani, zastosowanie inhibitorów iNOS, takich jak NG-monometylo-L-arginina (L-NMMA), powodowało zwiększenie przeżywalności i zjadliwości pasożytów w makrofagach [33,35,37,38]. Po zaszczepieniu L. major myszy z genetyczną podatnością na rozwój infekcji Leishmania (BALB/C) nie zaobserwowano aktywności iNOS. Jednak zastosowanie IL-12 było w stanie kontrolować infekcję poprzez aktywację iNOS [31]. Na ludziach przeprowadzono kilka badań klinicznych z miejscowymi terapiami zawierającymi donory NO [39,40]. W Ekwadorze nasza grupa opracowała i przetestowała krem ​​do stosowania miejscowego wytwarzający NO z S-nitrozo-N-acetylopenicylaminą (SNAP), wykazujący korzystny wpływ w leczeniu tego typu owrzodzeń bez doniesień o jakichkolwiek poważnych zdarzeniach niepożądanych. Niemniej jednak, ze względu na niestabilne uwalnianie tlenku azotu, krem ​​musiał być nakładany często (4 razy dziennie), co utrudniało przestrzeganie kuracji [39]. W Syrii inna grupa stosowała azotan potasu zakwaszony kwasem salicylowym i kwasem askorbinowym do miejscowego leczenia L. tropica [40]. In vitro, ta mieszanina wytwarzająca NO zniszczyła amastigoty i promastigoty Leishmania; jednak in vivo badanie 40 pacjentów dało niespójne wyniki, zmniejszając rozmiar owrzodzenia u 28% badanych i gojąc tylko 12%. Uważa się, że rozbieżność w tych wynikach wynika z techniki zastosowanej do uzyskania NO. Zakwaszenie azotynów powoduje natychmiastowy wyrzut NO, ale jego uwalnianie nie utrzymuje się przez długi czas [40]. Trudność kontrolowania uwalniania NO stworzyła konieczność poszukiwania nowych technik regulacji jego uwalniania. Polimery nanowłókien wytwarzane techniką elektroprzędzenia zostały przebadane w celu zagwarantowania stałego uwalniania farmaceutyków na zmianę chorobową. W procesie elektroprzędzenia wysokie napięcie jest wykorzystywane do wytworzenia naładowanego elektrycznie strumienia roztworu polimeru, który wysycha i krzepnie, pozostawiając suche włókno polimerowe [41]. Gdy ten strumień przemieszcza się w powietrzu, rozpuszczalnik odparowuje, pozostawiając naładowane włókno, które można odchylić elektrycznie i zebrać na metalowym ekranie [42,43]. Włókna o różnych kształtach i rozmiarach przekroju poprzecznego są wytwarzane z różnych polimerów. Dzięki tej technice udało się kapsułkować lub uwięzić kilka farmaceutyków, enzymów i białek. W poprzednim badaniu z powodzeniem zastosowano plastry nanowłókien jako nośniki uwalniające chlorowodorek tetracykliny. Uwalnianie tetracykliny było stałe przez okres 5 dni [41;43]. Korzystając z tego samego modelu, wyprodukowano wielowarstwowy plaster transdermalny, w którym azotyn jest związany z żywicą jonowymienną (DOWEX) i elektroprzędzony w warstwę nanowłókien poliuretanowych. Roztwór zawierający superabsorbent Waterlock® i poliuretan jest elektroprzędzony na wierzchu warstwy nitrytu-DOWEX. Kwas askorbinowy uwięziony w roztworze poliuretanowym jest elektroprzędzony na trzecią warstwę, z kolejną warstwą superabsorbentu Waterlock® i poliuretanu jako czwartą i ostatnią. Po uwodnieniu plaster uwalniający tlenek azotu (NOP) wytwarza stabilne uwalnianie 3,5 µmola NO w ciągu 12 godzin [41,44,45]. W badaniu pilotażowym, opracowanym w Landazuri, Santander, Kolumbia, przeprowadzono kontrolowane placebo badanie kliniczne z udziałem 35 pacjentów, u których wystąpiło 68 wrzodów wywołanych przez L. panamensis.Stosując NOP zaobserwowano 65% poprawę w leczonych owrzodzeniach, przy jedynie 25% poprawie w grupie placebo (p=0,001). W tym badaniu pilotażowym jedynym opisanym zdarzeniem niepożądanym był świąd w miejscu naklejenia plastra (dane niepublikowane). Biorąc pod uwagę szerokie rozpowszechnienie CL, zmiany w sposobie jego przenoszenia oraz trudności związane z dostępnością leków, niniejsze badanie proponuje zbadanie, czy plaster transdermalny z donorem NO, wytwarzany metodą elektroprzędzenia, jest co najmniej tak samo skuteczny jak antymonian megluminy do leczenia CL, z mniejszą liczbą działań niepożądanych i niższym kosztem, stanowiąc tym samym skuteczną alternatywę terapeutyczną. W przypadku wykazania skuteczności NOP w tym badaniu, udostępniona zostanie nowatorska i bezpieczna alternatywa terapeutyczna o łatwym dostępie i lepszym przestrzeganiu jednego z najważniejszych problemów zdrowia publicznego w naszym kraju.

CELE

Cel ogólny

Ocena skuteczności i bezpieczeństwa NOP w leczeniu CL w porównaniu z antymonianem megluminy (Glucantime®).

Konkretne cele

1. Ocena szybkości gojenia owrzodzeń CL za pomocą NOP w porównaniu z planem leczenia antymonianem megluminy zalecanym przez Ministerstwo Zdrowia.
2. Identyfikacja działań niepożądanych związanych ze stosowaniem NOP i porównanie ich z działaniami wywołanymi przez leczenie antymonianem megluminy.
3. Aby zidentyfikować i porównać recydywy, które mogą wystąpić zarówno w przypadku NOP, jak i antymonianu megluminy.
4. Postęp w poszukiwaniu alternatywy terapeutycznej dla CL w Kolumbii.

PROJEKT

Podwójnie ślepe, randomizowane, podwójnie maskowane, kontrolowane placebo badanie kliniczne, porównujące plastry uwalniające tlenek azotu z antymonianem megluminy.

WIELKOŚĆ PRÓBKI

Próbkę obliczono zgodnie ze wzorem arcus cosinus stosując moc 80% i błąd typu 1 wynoszący 0,05%. Przypisując pomyślny wskaźnik 85% dla antymonianu megluminy i 75% dla NOP, potrzebnych będzie 558 pacjentów. Po uwzględnieniu wskaźnika utraty wynoszącego 5%, całkowita liczba pacjentów, których należy zrekrutować, wynosi 620 (310 pacjentów na grupę leczoną).

POPULACJA

Populacja będzie się składać z dwóch regionów Kolumbii. Pierwsza z nich to strefa endemiczna w Santander w Kolumbii, położona między Doliną Magdaleny a Pasmem Gór Wschodnich, która obejmuje gminy Landazuri, El Carmen, San Vicente, El Playon i Rionegro. Drugi region to strefa endemiczna w północnej Tolimie, która obejmuje gminy Chaparral, San Antonio, Libano, Falan, Palocabildo i Mariquita.

SELEKCJA PACJENTÓW

Kryteria przyjęcia

1. Mężczyźni i kobiety w wieku od 18 do 50 lat
2. Owrzodzenia skóry trwające dłużej niż dwa tygodnie ewolucji
3. Pozytywna diagnoza parazytologiczna dla CL
4. Pacjenci, którzy dobrowolnie wyrażą zgodę na udział w badaniu i podpiszą świadomą zgodę.
5. Dyspozycja do punktualnego przychodzenia na wszystkie wizyty (wstępne, lecznicze i kontrolne)
6. Akceptacja niestosowania żadnego innego leczenia CL podczas badania

Kryteria wyłączenia

1. Kobiety w ciąży
2. Obecność jakiegokolwiek stanu lub choroby, które upośledzają układ immunologiczny pacjenta (tj. cukrzyca, rak itp.) lub jakiekolwiek inne, które w ocenie badacza mogą zmienić przebieg CL.
3. Rozlany CL lub więcej niż pięć aktywnych zmian.
4. Leiszmanioza śluzówkowo-skórna (żadna zmiana nie może być zlokalizowana w odległości mniejszej niż 2 cm od błony śluzowej nosa, dróg moczowo-płciowych i/lub odbytu lub krawędzi warg).
5. Leiszmanioza trzewna
6. Całkowite lub niepełne leczenie związkami antymonu w ciągu ostatnich trzech miesięcy.
7. Pacjenci z chorobami wątroby, nerek lub układu krążenia w wywiadzie.
8. Pacjenci niepełnosprawni umysłowo lub neurologicznie, których uznano za niezdolnych do wyrażenia zgody na udział w badaniu.

ROZWÓJ STUDIÓW

Faza logistyczna

Ta faza potrwa 4 miesiące i obejmie następujące działania:

1. Szkolenie personelu, który będzie uczestniczył w badaniu.
2. Pozyskanie materiałów niezbędnych do opracowania projektu.
3. Opracowanie ulotek, materiałów promocyjnych i edukacyjnych, podręczników procedur i formularzy opisów przypadków (CRF).
4. Randomizacja leczenia. Randomizacja leczenia zostanie przeprowadzona przez epidemiologa Cardiovascular Foundation of Colombia. Ta randomizacja zostanie przeprowadzona w blokach, aby utrzymać podobną wielkość grup terapeutycznych, aby uniknąć długich sekwencji tego samego leczenia i zrównoważyć, jeśli to możliwe, pewne uprzedzenia właściwe dla prostego procesu randomizacji. Dodatkowo ta randomizacja w blokach ułatwi wykonanie analiz pośrednich.

Faza rekrutacji

Ta faza potrwa 22 miesiące. W wybranych gminach personel medyczny pracujący w szpitalach i ośrodkach zdrowia zostanie przeszkolony w zakresie choroby i metodologii badań. Równocześnie z przywódcami społeczności i personelem medycznym zostanie przeprowadzone ogniskowe badanie epidemiologiczne w celu określenia warunków geograficznych i demograficznych w celu opracowania strategii rekrutacji potencjalnych przypadków leiszmaniozy. Następnie osoby z aktywnymi owrzodzeniami trwającymi dłużej niż 2 tygodnie, z parazytologicznym potwierdzeniem CL lub bez niego, zostaną zaproszeni przez promotorów zdrowia do wzięcia udziału w wizycie przesiewowej (Tabela 1).

Wizyta przesiewowa

Podczas tej wizyty zostanie opracowany pełny wywiad kliniczny i uzyskane zostaną dane dotyczące prekursorów leiszmaniozy (stosowane leczenie, lokalizacja, liczba zmian itp.). Pełna ocena medyczna zostanie przeprowadzona w oparciu o powszechnie akceptowane techniki. Zastosowane zostaną kryteria włączenia/wyłączenia, a wybrani kandydaci zostaną poinformowani o badaniu, po czym podpiszą świadomą zgodę. W przypadku osobników z owrzodzeniami trwającymi dłużej niż dwa tygodnie bez diagnozy parazytologicznej zostanie przeprowadzone bezpośrednie badanie przez parazytologa. Jeśli pierwszy bezpośredni test jest negatywny, zostanie powtórzony do trzech razy; po czym w przypadku wyniku ujemnego zostanie wykonana biopsja. Jeśli leiszmanioza nie zostanie potwierdzona, pacjent zostanie skierowany do pierwotnego ośrodka zdrowia.

Pierwsza wizyta

Włączeni pacjenci zostaną losowo przydzieleni do jednej z dwóch grup. Hodowla w podłożu Novy-Nicole-McNeal (NNN) zostanie pobrana w celu identyfikacji szczepu, a próbka krwi pobrana z żyły łokciowej w celu oznaczenia enzymów wątrobowych, kreatyniny i amylazy trzustkowej. Podczas tej wizyty zostanie przeprowadzona pełna ocena lekarska, dokonany zostanie pomiar owrzodzenia oraz zostanie wykonane zdjęcie. Przed wykonaniem zdjęcia obok owrzodzenia zostanie umieszczona podziałka wraz z naklejką z kodem identyfikacyjnym uczestnika oraz datą wizyty. Pierwszy NOP (aktywny lub placebo) zostanie zastosowany na pokrycie zmiany i podany zostanie pierwszy zastrzyk antymonianu megluminy (aktywny lub placebo). Pacjenci otrzymają informacje, jak nie uszkodzić plastrów oraz jak rozpoznawać i zgłaszać zdarzenia niepożądane. Aby w tym pomóc pacjentom, otrzymają oni dzienniczek, w którym będą mogli się zarejestrować. Dwie losowo utworzone grupy zostaną podzielone w następujący sposób:

Grupa 1: W ciągu 20 dni ta grupa będzie otrzymywać jednocześnie domięśniowo (IM) antymonian megluminy (Glucantime® 20 mg/kg/dzień z maksymalną dawką 3 ampułek dziennie); i placebo NOP.

Grupa 2: W ciągu 20 dni ta grupa będzie otrzymywać jednocześnie placebo w postaci antymonianu megluminy domięśniowo (5-15 cm3/dzień) i aktywny NOP.

Wizyty lecznicze

Pacjenci będą odwiedzać ośrodek zdrowia codziennie przez 20 dni, aby otrzymywać zarówno NOP (placebo lub aktywny), jak i antymonian megluminy (placebo lub aktywny). Codziennie oceniane będą osoby i ich przestrzeganie w leczeniu oraz gromadzone dane. W przypadku wykrycia zdarzenia niepożądanego pacjent zostanie niezwłocznie skierowany do personelu medycznego, który dokona oceny i zgłosi ją do komisji zdarzeń niepożądanych, która podejmie ostateczną decyzję w każdym przypadku.

Wizyty kontrolne

Ta faza potrwa 10 miesięcy. Podczas obserwacji pacjenci będą przyjmowani przez grupę badawczą w 4 sytuacjach. Pierwsza wizyta odbędzie się dzień po zakończeniu kuracji (dzień 21) podczas której zostaną pobrane nowe próbki krwi do oznaczeń biochemicznych. Druga, trzecia i czwarta wizyta będą realizowane odpowiednio w 45, 90 i 180 dniu. Podczas tych wizyt oceniany będzie proces gojenia się owrzodzenia, obecność recydywy i/lub reinfekcji oraz stan zdrowia uczestników. Ewolucja wrzodów zostanie zarejestrowana fotograficznie.

Maksymalna i minimalna średnica owrzodzenia zostanie zmierzona za pomocą linijki z podziałką, a stwardnienie za pomocą długopisu. Obszary owrzodzenia i stwardnienia zostaną obliczone oddzielnie, a następnie zarejestrowane w CRF. Ocena odpowiedzi klinicznej będzie oparta na owrzodzeniu wykazującym najmniejszą poprawę.

1. Całkowita odpowiedź kliniczna: Całkowita reepitelizacja owrzodzenia i zniknięcie stwardnienia.
2. Poprawa kliniczna: Zmniejszenie powierzchni owrzodzenia i stwardnienia o ponad 50% w stosunku do ostatniej oceny klinicznej.
3. Brak odpowiedzi klinicznej: Zwiększenie lub zmniejszenie o mniej niż 50% obszaru owrzodzenia i stwardnienia w stosunku do ostatniej oceny klinicznej.

4. Niepowodzenie terapeutyczne:

   1. Zwiększenie wielkości owrzodzenia o ponad 50% w stosunku do ostatniej oceny klinicznej
   2. Obecność owrzodzenia po trzech miesiącach od rozpoczęcia leczenia.
   3. Reaktywacja: Pojawienie się zmiany na brzegu lub w centrum blizny, z pozytywnym rozpoznaniem parazytologicznym, po okresie całkowitej reepitelizacji.
   4. Zapalenie błon śluzowych: Obecność zmian chorobowych błon śluzowych w trakcie leczenia, na jego końcu lub podczas wizyt kontrolnych.
5. Reinfekcja: Aktywacja owrzodzenia w obszarze innym niż pierwotna zmiana.

W przypadku pacjentów, których leczenie zostanie uznane za niepowodzenie, kod zostanie złamany i zostaną oni skierowani do pierwotnego ośrodka zdrowia w celu poszukiwania innego podejścia terapeutycznego.

Procedury

Badanie lekarskie

Zostanie przeprowadzone pełne badanie fizykalne i zostaną zmierzone parametry życiowe.

Pobrane próbki krwi

Próbki krwi zostaną pobrane z żyły łokciowej w celu wykonania następujących analiz biochemicznych:

1. Kreatynina metodą spektrofotometryczną
2. Transaminaza alaninowa (ALT) metodą spektrofotometryczną
3. Transaminaza asparaginianowa (AST) metodą spektrofotometryczną
4. Amylaza trzustkowa metodą spektrofotometryczną

Technika pobierania próbek do bezpośredniego testu CL

Wykonuje się badanie bezpośrednie w celu potwierdzenia obecności komórek z amastygotami w zeskrobinie skóry właściwej [46,47]; próbka musi być, o ile to możliwe, wolna od krwi, pozostałości komórkowych lub ropy. Jeśli u pacjentów występuje kilka zmian, próbkę należy pobrać z tej, która ma najkrótszy czas ewolucji, największy obszar stwardnienia i/lub najmniej ropną wydzielinę. Jeśli zmiana ma strup, należy go usunąć, aby poprawić jakość próbki. Próbkę można pobrać z czynnej krawędzi lub z dna owrzodzenia. Kiedy próbka jest pobierana z aktywnej krawędzi, należy zachować aseptykę alkoholem o stężeniu 70%, a następnie wykonać hemostazę za pomocą pierwszego i drugiego palca, aby upewnić się, że w próbce nie ma krwi. Małe nacięcie o długości i głębokości około 3 mm wykonuje się skalpelem w aktywnej krawędzi równolegle do krawędzi owrzodzenia. Ostrą stroną skalpela wykonuje się zeskrobanie ściany właściwej nacięcia w celu uzyskania tkanki. Wyekstrahowany materiał jest rozciągany na dwóch szkiełkach mikroskopowych. Próbkę suszy się w temperaturze pokojowej, a następnie utrwala metanolem i barwi metodą Giemsy, Wrighta lub Fielda. Za pomocą olejku immersyjnego obserwuje się próbkę pod mikroskopem z soczewką 100X, ocenia się obecność amastigotów z rodzaju Leishmania oraz weryfikuje się ich budowę (jądro, kinetoplast i błona komórkowa). Jeśli próbka zostanie pobrana ze środka zmiany, należy zastosować tę samą technikę hemostatyczną, usunąć strup i dobrze oczyścić dno owrzodzenia za pomocą ostrej strony skalpela, aby zapobiec obecności szczątków komórkowych i/lub ropnej substancji . Ta procedura musi być kontynuowana, aż ziarniniaki będą widoczne na dole. Przy użyciu tej samej techniki, która została zastosowana do obróbki próbek z aktywnego brzegu, weryfikowana jest obecność amastigotów z rodzaju Leishmania.

Technika pobierania próbek kultur

Próbkę do posiewu można pobrać poprzez odessanie aktywnego brzegu wrzodu lub ekstrakcję fragmentu tkanki, który następnie maceruje się w roztworze soli buforowanym fosforanami (PBS) z antybiotykami (1000 UI penicyliny krystalicznej na cm3), zanim zostanie umieścić w pożywce hodowlanej. W technice odsysania stosuje się strzykawkę tuberkulinową z cienką igłą (26G), zawierającą 0,3 cm3 roztworu PBS z antybiotykami. Po uprzedniej aseptyce owrzodzenia 70% alkoholem wprowadza się igłę do skóry właściwej i ruchami obrotowymi maceruje się przez skos igły niewielką ilość tkanki przez około minutę, po czym zasysa się ją do strzykawki. Próbkę umieszcza się w warunkach aseptycznych w pożywce hodowlanej NNN i inkubuje w temperaturze 26ºC przez 4 tygodnie [46,47]. Co tydzień pobiera się kroplę z pożywki hodowlanej i umieszcza pomiędzy dwoma szkiełkami w celu obserwacji pod mikroskopem. W przypadku braku obecności promastigotów posiewy są odrzucane jako ujemne [46]. Szczepy są identyfikowane według gatunków przy użyciu przeciwciał monoklonalnych opracowanych przez dr Diane Mc Mahon Pratt [48,49].

Ocena i zarządzanie zdarzeniami niepożądanymi

W trakcie leczenia i wizyt kontrolnych pacjenci będą pytani o zdarzenia niepożądane. Każde zdarzenie niepożądane zostanie sklasyfikowane przez lekarza jako poważne lub nieciężkie (Tabela 2 i 3). Poważne zdarzenie niepożądane powinno spełniać jedno lub więcej z następujących kryteriów:

1. Śmierć
2. Zagrażające życiu (tj. Bezpośrednie ryzyko śmierci)
3. Hospitalizacja stacjonarna lub przedłużenie istniejącej hospitalizacji
4. Utrzymująca się lub znaczna niepełnosprawność/niezdolność Wystąpienie poważnego zdarzenia niepożądanego, które zagraża życiu pacjenta i/lub wymaga natychmiastowej interwencji medycznej lub chirurgicznej, będzie wymagało przerwania leczenia i rozpoczęcia odpowiedniego postępowania medycznego z pacjentami. Badacz powiadomi Komitet ds. Zdarzeń Niepożądanych (AEC) FCV o każdym poważnym zdarzeniu niepożądanym w ciągu 24 godzin od uzyskania informacji o nim.

Niepoważne zdarzenie niepożądane zostanie sklasyfikowane w następujący sposób:

1. Łagodne: Pacjenci są świadomi swoich objawów i/lub oznak, ale są one do zniesienia. Nie wymagają interwencji lekarskiej ani specyficznego leczenia.
2. Umiarkowane: Pacjenci zgłaszają problemy, które zakłócają ich codzienne czynności. Wymagają interwencji medycznej lub specyficznego leczenia.
3. Ciężkie: Pacjenci nie są w stanie pracować ani uczestniczyć w codziennych czynnościach. Wymagają interwencji medycznej lub specyficznego leczenia.

Ewentualny związek między zdarzeniami niepożądanymi a badanym lekiem zostanie sklasyfikowany przez badacza na podstawie jego oceny klinicznej i następujących definicji:

1. Zdecydowanie powiązane: Zdarzenie można w pełni wyjaśnić podaniem badanego leku.
2. Prawdopodobnie powiązane: Zdarzenie najprawdopodobniej można wytłumaczyć podaniem badanego leku zamiast innych leków lub stanem klinicznym pacjenta.
3. Możliwy związek: Zdarzenie można wytłumaczyć podaniem badanego leku lub innych leków lub stanem klinicznym pacjenta.
4. Niepowiązane: Zdarzenie najprawdopodobniej można wyjaśnić stanem klinicznym pacjenta lub innymi lekami, a nie testowanym.

Wszystkie zdarzenia będą zgłaszane do AEC, które w zależności od swoich kryteriów podejmie decyzję o kontynuacji lub wycofaniu pacjenta z badania, a tym samym złamaniu szyfru.

Chociaż projekt został zaprojektowany tak, aby zminimalizować nieodłączne ryzyko, wszelkie zdarzenia niepożądane związane z badanymi lekami zostaną dokładnie ocenione przez AEC, a koszty wygenerowane przez wymagane leczenie zostaną pokryte z badania.

Faza analizy danych

Ta faza potrwa 6 miesięcy. Po wprowadzeniu wszystkich danych do CFR wyniki zostaną poddane audytowi, a wykryte błędy ocenione i poprawione przez osobę odpowiedzialną. Informacje zostaną wprowadzone do dwóch różnych baz danych przez dwie różne osoby, a zapisy zostaną porównane w celu wykrycia wszelkich rozbieżności. Oryginalny CFR zostanie użyty do poprawienia wszelkich błędów w bazie danych.

Do analizy statystycznej zostanie wykorzystany Stata 8.0. Analiza opisowa będzie składać się z median i proporcji zgodnie z charakterem zmiennych, z odpowiednimi 95% przedziałami ufności. Jako pomiar dyspersji zostanie obliczone odchylenie standardowe. Rozkłady zmiennych będą badane za pomocą testu Shapiro-Wilka. Aby wykryć jakąkolwiek różnicę między grupami, zostanie przeprowadzony test T lub test Wilcoxona zgodnie z jego rozkładem. Zmienne kategoryczne zostaną porównane za pomocą testu Chi2 lub dokładnego testu Fishera. W razie potrzeby zostanie wykonany model wielokrotnych regresji logistycznych lub analiza kowariancji.

Po pobraniu 35% i 70% obliczonej próbki zostaną przeprowadzone dwie analizy pośrednie w celu określenia różnic w skuteczności i bezpieczeństwie między zabiegami.

Punkty końcowe

Na koniec badania zostaną ocenione dwa punkty końcowe:

1. Skuteczne leczenie:

   1. Pełna reepitelizacja po trzech miesiącach od rozpoczęcia kuracji.
   2. Brak reaktywacji i zmian chorobowych błon śluzowych w ciągu 6 miesięcy badania.

2. Niepowodzenie leczenia:

   1. Niepełna reepitelizacja po trzech miesiącach od rozpoczęcia leczenia.
   2. Zwiększenie wielkości owrzodzenia o ponad 50% w stosunku do ostatniej oceny klinicznej
   3. Reaktywacja i/lub zmiany chorobowe błon śluzowych w ciągu 6 miesięcy badania.

Raport końcowy

Na koniec badania wyniki zostaną ocenione i omówione, a raport końcowy przedstawiony COLCIENCIAS, podmiotowi sponsorującemu projekt. Uzyskane wyniki zostaną opublikowane w czasopismach krajowych i zagranicznych oraz zaprezentowane na kongresach i spotkaniach naukowych.

ASPEKTY ETYCZNE

Badanie to zostanie przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i kolumbijskim ustawodawstwem zgodnie z Rozporządzeniem 8430/93 Ministerstwa Zdrowia. Przed przyjęciem pacjentów do badania zostaną wyjaśnione cele i metodologia oraz uzyskana zostanie świadoma zgoda. Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Badań Fundacji Cardiovascular w Kolumbii (ustawa nr 105/28 stycznia 2005 r.). Prawo do poufności pacjentów zostanie zachowane na wszystkich etapach badania.

KONKURENCYJNE INTERESY

Niefinansowe konkurencyjne interesy

Autorzy tego manuskryptu oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów, w tym politycznych, osobistych, religijnych, ideologicznych, akademickich, intelektualnych ani żadnych innych konkurencyjnych interesów.

Konkurencyjne interesy finansowe

W ciągu ostatnich pięciu lat nie otrzymaliśmy zwrotów, opłat, funduszy ani wynagrodzeń od żadnej organizacji, która mogłaby w jakikolwiek sposób zyskać lub stracić na publikacji tego manuskryptu, teraz lub w przyszłości. Nie posiadamy żadnych akcji ani udziałów w organizacji, która mogłaby w jakikolwiek sposób zyskać lub stracić finansowo na publikacji manuskryptu, teraz lub w przyszłości. Nie posiadamy ani nie ubiegamy się obecnie o żadne patenty dotyczące treści manuskryptu. Nie otrzymaliśmy zwrotu kosztów, opłat, funduszy ani wynagrodzenia od organizacji, która posiada lub wystąpiła o patenty dotyczące treści manuskryptu.