可控一氧化氮释放贴剂与锑酸葡甲胺治疗皮肤利什曼病

背景

皮肤利什曼病 (CL) 是一种世界性疾病，在 88 个国家/地区流行 [1]。 据估计，每年有 150 万人患有 CL，超过 3.5 亿人有感染该病的风险 [2-4]。 在美国，每年报告 60,000 例 CL 新病例 [5]，在美国 22 个国家中的 20 个国家和加勒比海的 2 个岛屿中流行 [2]。 目前，CL 已经影响了 500 多名在伊拉克服役的美国陆军士兵 [6]。 在安第斯地区，利什曼病的发病率在过去二十年急剧增加；从 1996-98 年，每年达到 14,000 多例 [7]。 哥伦比亚已报告 6,500 例病例 [8]。 哥伦比亚报告的 CL 病例增加与移民、森林砍伐、非法种植园的繁殖、武装政治冲突和病媒行为改变等因素有关。 哥伦比亚利什曼原虫的主要菌株是 L. panamensis、L. brazilensis、L. infantum 和 L. guyanensis，分布在全国各地，主要分布在农村地区 [10]。 CL 由利什曼原虫属的细胞内原生动物寄生虫引起 [1]，并通过迄今为止分类的一小部分白蛉和 lutzomyia 白蛉的叮咬传播给人类 [10]。 在白蛉的消化系统中，这种双态寄生虫呈现出一种称为前鞭毛体的细胞外鞭毛形式，它在宿主血液中释放后，被巨噬细胞吞噬，失去鞭毛并变成无鞭毛体 [12]。 狗、啮齿动物和双海豚科动物是该寄生虫的自然宿主，而人是偶然宿主[11]。 这种人畜共患病经历了一个有趣的城市化现象，从主要影响活跃年龄男性的著名农村实体转变为影响所有人，尤其是儿童的疾病 [8,9]。 这种疾病的特征性病变是溃疡，根据分离株的不同，会在三个月到一年的时间内自愈，并留下扁平、萎缩和脱色的疤痕 [13-15]。 CL，尤其是 L. brazilensis 产生的 CL，可演变成粘膜皮肤利什曼病 (MCL)，由于其病变的变形特征，其预后较差 [16]。 这些病变的自发治愈允许获得对再感染的部分抵抗力，这可以解释在儿童和青年人群中观察到的较高致病性 [9]。 以前的研究表明，儿童 CL 的发病率较高，对治疗的反应较差 [17]。 哥伦比亚的流行病学警戒计划要求可能的 CL 病例（通过溃疡特征和患者来源确定）通过直接显微镜检查从溃疡中获取的分离样本进行确认，如果结果为阴性，则通过伤口活组织检查. 一旦确认，必须使用临床流行病学记录将病例通知当地卫生部长。 该机构负责流行病学警戒，研究传播源并向受影响的人分发药物。 目前，在治疗 CL 时要考虑多个方面，其中最重要的是发展为 MCL 的风险、病灶的分级、定位、数量、大小、演变和持续性 [18]。 60 多年来，五价锑化合物：葡萄糖酸锑钠（Pentostan®，由 Glaxo-Wellcome 生产）和葡甲胺锑酸盐（Glucantime®，由 Sanofi-Aventis 生产）一直被认为是治疗这种疾病的首选 [19 ]. 哥伦比亚进行的研究报告使用葡甲胺锑酸盐的治愈率为 85% [20,21]。 尽管这些药物的疗效很高，但它们存在许多缺点，例如肠胃外给药，以及可逆的副作用，例如恶心、呕吐、肌肉和腹痛、心脏问题、肝转氨酶浓度升高，以及化学性胰腺炎 [21,22]。 此外，对治疗的依从性受其持续时间（数周）和其分发限制的可用性的影响。 已提出二线治疗方案；两性霉素 B 和喷他脒已被使用并取得了很好的效果，但它们的成本高、可用性低、患者需要住院才能使用它们以及副作用的严重性限制了它们的使用 [23,24]。 在过去的十年中，已经开发了 CL 的新疗法，使用甲氟喹、伊曲康唑、米替福新、巴龙霉素、酮康唑、别嘌醇和氨苯砜等口服药物，但是，它们尚未显示出足够的有效性证据 [19,21,25,26 ]. 为了开发 CL 的局部治疗，巴龙霉素已用于不同的制剂中。 然而，即使与安慰剂相比，这种药物的治愈率也不高于常规治疗 [27,28]。 几项体外和体内研究表明，一氧化氮 (NO) 可有效消除无鞭毛体形式的各种利什曼原虫菌株 [29-35]。 由诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 引起的 L-精氨酸氧化产生的 NO 构成了巨噬细胞最重要的防御机制之一 [36]，其中已鉴定出两种针对利什曼原虫的氧化防御形式。 在感染的第一阶段，响应吞噬过程，一些前鞭毛体由于超氧离子的释放而被消除，该过程由 NADPH 氧化酶催化 [29]。 那些在这种防御机制下存活下来的前鞭毛体进化成无鞭毛体，激活巨噬细胞中 IL-12 的产生，并促进利什曼原虫抗原 [29] 呈递给 T 辅助细胞 1 淋巴细胞，从而增强巨噬细胞对细胞内细胞的细胞毒活性寄生虫通过干扰素γ（INFγ）和肿瘤坏死因子α（TNFα）促进iNOS催化的NO的产生[31-33]。 最近的一项研究表明，感染 CL 的受试者的巨噬细胞中 iNOS 的活性更高，表明 NO 在针对利什曼原虫的免疫活性中起着至关重要的作用 [34]。 在对利什曼原虫感染具有抗性的啮齿动物 (C57BL/6) 的研究中，接种了大利什曼原虫、查加斯利什曼原虫或杜氏利什曼原虫，iNOS 抑制剂如 NG-单甲基-L-精氨酸 (L-NMMA) 的应用导致更高的巨噬细胞中寄生虫的存活率和毒力 [33,35,37,38]。 在对具有利什曼原虫 (BALB/C) 感染遗传易感性的小鼠接种大利什曼原虫后，未观察到 iNOS 的活性。 然而，IL-12 的应用能够通过激活 iNOS 来控制感染 [31]。 在人类中，已经通过包含 NO 供体的局部治疗实现了几项临床试验 [39,40]。 在厄瓜多尔，我们的小组开发并测试了一种含有 S-亚硝基-N-乙酰青霉胺 (SNAP) 的不会产生 NO 的外用乳膏，证明在治疗此类溃疡方面具有有益效果，并且没有任何严重不良事件的报告。 然而，由于一氧化氮释放不稳定，必须经常使用乳膏（每天 4 次），难以坚持治疗 [39]。 在叙利亚，另一组使用用水杨酸和抗坏血酸酸化的硝酸钾来局部治疗热带乳杆菌 [40]。 在体外，这种产生 NO 的混合物破坏了利什曼原虫的无鞭毛体和前鞭毛体；然而，在体内，对 40 名患者的研究呈现出不一致的结果，28% 的受试者溃疡面积减小，仅 12% 愈合。 这些结果的差异被认为是由于用于获得 NO 的技术造成的。 亚硝酸盐的酸化会立即产生 NO，但其释放不会持续很长时间 [40]。 控制 NO 释放的困难导致寻找新技术来调节其释放的必要性。 已经研究了通过静电纺丝技术生产的纳米纤维聚合物，以保证药物在病灶上的持续释放。 在静电纺丝过程中，使用高压来产生带电的聚合物溶液射流，该溶液干燥并固化，留下干燥的聚合物纤维 [41]。 当这种射流穿过空气时，溶剂会蒸发，留下带电的纤维，该纤维可以被电偏转并收集在金属屏幕上 [42,43]。 具有各种横截面形状和尺寸的纤维由不同的聚合物制成。 通过这种技术，几种药物、酶和蛋白质的封装或包埋已经成功。 在之前的一项研究中，纳米纤维贴片成功地用作四环素盐酸盐的释放载体。 四环素的释放持续 5 天 [41;43]。 使用相同的模型，生产了一种多层透皮贴剂，其中亚硝酸盐与离子交换树脂 (DOWEX) 结合并电纺成聚氨酯纳米纤维层。 含有 Waterlock® 超吸水剂和聚氨酯的溶液在亚硝酸盐-DOWEX 层的顶部进行静电纺丝。 包裹在聚氨酯溶液中的抗坏血酸被电纺到第三层上，另一层 Waterlock® 超吸水剂和聚氨酯作为第四层也是最后一层。 水合作用后，这种一氧化氮释放贴片 (NOP) 会在 12 小时内稳定释放 3.5 µmol 的 NO [41,44,45]。 在哥伦比亚桑坦德兰达祖里开展的一项试点研究中，对 35 名出现 68 个由 L. panamensis 引起的溃疡的患者进行了安慰剂对照临床试验。使用 NOP，在治疗的溃疡中观察到 65% 的改善，安慰剂组仅改善 25% (p=0.001)。 在这项初步研究中，描述的独特不良事件是贴片应用区域的瘙痒症（未发表的数据）。 考虑到 CL 的广泛分布、其传播形式的变化以及与药物可用性相关的困难，本研究提议调查静电纺丝生产的 NO 供体透皮贴剂是否至少与 NO 供体透皮贴剂一样有效锑酸葡甲胺用于治疗 CL，不良反应少，成本低，因此是一种有效的治疗选择。 如果 NOP 的有效性在本研究中得到证实，将提供一种新颖且安全的治疗替代方案，该替代方案易于获取且依从性更高，可以解决我国最重要的公共卫生问题之一。

目标

总体目标

评估 NOP 与锑酸葡甲胺 (Glucantime®) 相比治疗 CL 的有效性和安全性。

具体目标

1. 与卫生部推荐的锑酸葡甲胺治疗方案相比，评估使用 NOP 治疗 CL 溃疡的治愈率。
2. 确定与 NOP 应用相关的不良事件，并将它们与用锑酸葡甲胺处理产生的不良事件进行比较。
3. 识别和比较 NOP 和葡甲胺锑酸盐可能发生的累犯。
4. 推进在哥伦比亚寻找 CL 的治疗替代方案。

设计

双盲、随机、双盲、安慰剂对照临床试验，比较一氧化氮释放贴片与葡甲胺锑酸盐。

样本大小

根据反余弦公式使用 80% 的功效和 0.05% 的 1 类误差计算样本。 假设葡甲胺锑酸盐的成功率为 85%，NOP 的成功率为 75%，则需要 558 名患者。 在针对 5% 的损失率进行调整后，必须招募的患者总数为 620 名（每个治疗组 310 名患者）。

人口

人口将由哥伦比亚的两个地区组成。 第一个是哥伦比亚桑坦德的流行区，位于马格达莱纳山谷和东部山脉之间，包括兰达祖里、埃尔卡门、圣维森特、埃尔普拉翁和里奥内格罗等市镇。 第二个地区是北托利马的流行区，包括 Chaparral、San Antonio、Libano、Falan、Palocabildo 和 Mariquita 市。

患者的选择

纳入标准

1. 18 至 50 岁的男性和女性
2. 两周多进化的皮肤溃疡
3. CL 寄生虫学诊断阳性
4. 自愿同意参加研究并签署知情同意书的患者。
5. 准时参加所有访问的处置（初始、治疗和后续）
6. 接受在研究期间不使用任何其他 CL 治疗

排除标准

1. 孕妇
2. 存在损害患者免疫学的任何病症或疾病（即 糖尿病、癌症等）或任何其他，根据研究人员的判断，可能会改变 CL 的过程。
3. 弥漫性 CL 或超过 5 个活动性病灶。
4. 皮肤粘膜利什曼病（任何病灶距离鼻腔、泌尿生殖器和/或肛门粘膜或唇缘的距离不得小于 2 厘米）。
5. 内脏利什曼病
6. 最近三个月内用锑化合物完成或不完全治疗。
7. 有肝病、肾病或心血管病史的患者。
8. 被认为不适合批准其参与研究的精神或神经残疾患者。

研究发展

后勤阶段

此阶段将持续 4 个月，包括以下活动：

1. 培训将参与研究的人员。
2. 获取项目开发所需的材料。
3. 制作传单、宣传和教育材料、程序手册和病例报告表 (CRF)。
4. 治疗随机化。 治疗随机化将由哥伦比亚心血管基金会的流行病学家实现。 这种随机化将分块进行，以保持治疗组的规模相似，避免相同治疗的长序列，并尽可能平衡简单随机化过程中固有的一些偏差。 此外，块中的这种随机化将有助于执行中期分析。

招聘阶段

这一阶段将需要 22 个月。 在选定的城市，在医院和保健中心工作的保健人员将接受有关疾病和研究方法的培训。 同时，将与社区领导和卫生人员一起进行流行病学重点研究，以确定地理和人口状况，目的是制定招募可能的利什曼病病例的战略。 随后，健康促进者将邀请出现活动性溃疡且演变超过 2 周的受试者，有或没有 CL 的寄生虫学确认（表 1）。

筛选访问

在这次访问期间，将详细阐述完整的临床病史，并获得有关利什曼病前因的数据（实施的治疗、定位、病变数量等）。 基于普遍接受的技术，将实现全面的医学评估。 将应用纳入/排除标准，选定的候选人将了解该研究，之后他们将签署知情同意书。 对于没有寄生虫学诊断且溃疡发展超过两周的受试者，寄生虫学家将进行直接测试。 如果第一次直接测试为阴性，最多重复三次；之后，如果结果为阴性，将进行活检。 如果未确诊利什曼病，患者将被转至原医疗中心。

初访

纳入的患者将被随机分配到两组中的一组。 Novy-Nicole-McNeal (NNN) 培养基中的培养物将用于菌株鉴定，并从肘前静脉抽取血样用于肝酶、肌酸酐和胰淀粉酶测定。 在这次访问期间，将进行完整的医学评估，测量溃疡并拍照。 拍照前，将在溃疡旁边放置一条刻度尺，并贴上标有参与者识别码和就诊日期的贴纸。 将应用第一个 NOP（活性或安慰剂）覆盖病变，并给予第一针锑酸葡甲胺（活性或安慰剂）。 患者将收到有关如何不损坏贴片以及如何识别和报告不良事件的信息。 为了帮助患者这样做，他们将收到一本日记以进行登记。 随机组成的两组将按如下方式进行分组：

第 1 组：在 20 天内，该组将同时接受肌内 (IM) 葡甲胺锑酸盐（Glucantime® 20 mg/kg/天，最大剂量为每天 3 安瓿）；和 NOP 安慰剂。

第 2 组：在 20 天内，该组将同时接受 IM 葡甲胺锑酸盐（5-15cc/天）和活性 NOP 的安慰剂。

治疗就诊

患者将在 20 天内每天访问健康中心，以接受 NOP（安慰剂或活性药物）和葡甲胺锑酸盐（安慰剂或活性药物）。 每天，将评估受试者及其对治疗的依从性并收集数据。 如果检测到任何不良事件，将立即将患者转介给医务人员，他们将进行评估并将其报告给不良事件委员会，该委员会将对每种情况做出最终决定。

后续访问

这一阶段将持续10个月。 在随访期间，患者将有 4 次机会被研究组看到。 第一次访问将在治疗结束后的第二天（第 21 天）进行，届时将采集新的血液样本进行生化测定。 第二次、第三次和第四次访问将分别在第 45、90 和 180 天实现。 在这些访问期间，将评估溃疡的愈合过程、再犯和/或再感染的存在以及参与者的健康状况。 溃疡的演变将被照相记录。

使用刻度尺测量溃疡的最大和最小直径，并使用圆珠笔技术测量硬结。 溃疡和硬结面积将分别计算，然后登记在 CRF 中。 临床反应的评估将基于表现出最少改善的溃疡。

1. 完全临床反应：溃疡完全再上皮化，硬结消失。
2. 临床改善：与上次临床评估相比，溃疡和硬结区域减少 50% 以上。
3. 无临床反应：与上次临床评估相比，溃疡和硬结区域的增加或减少小于 50%。

4. 治疗失败：

   1. 与上次临床评估相比，溃疡面积增加超过 50%
   2. 治疗开始后三个月出现溃疡。
   3. 再激活：经过一段时间的完全再上皮化后，疤痕边缘或中央出现病变，寄生虫学诊断呈阳性。
   4. 粘膜的影响：在治疗期间、治疗结束时或在后续访问中存在粘膜的影响。
5. 再感染：在与原始病变不同的区域激活溃疡。

对于治疗被认为失败的受试者，密码将被破解，他们将被送回原先的健康中心寻找另一种治疗方法。

程序

身体检查

将实现完整的身体检查并测量生命体征。

抽取血样

从肘前静脉抽取血样以进行以下生化分析：

1. 通过分光光度法测定肌酐
2. 通过分光光度法测定丙氨酸转氨酶 (ALT)
3. 通过分光光度法测定天冬氨酸转氨酶 (AST)
4. 分光光度法测定胰淀粉酶

CL直接测试的采样技术

进行直接测试以确认真皮刮擦中是否存在带无鞭毛体的细胞[46,47]；样本必须尽可能不含血液、细胞碎屑或脓液。 如果患者出现多个病灶，标本必须取自演变时间最短、硬结面积最大和/或脓性分泌物最少的病灶。 如果病变有结痂，则必须将其去除以提高样本质量。 样本可取自活动边缘或溃疡底部。 当样本从活动边缘取出时，必须使用 70% 的酒精进行无菌操作，然后使用食指和食指进行止血，以确保样本中没有血液。 用手术刀在与溃疡边缘平行的活动边缘做一个长和深约 3mm 的小切口。 用手术刀锋利的一面，在切口的真皮壁上进行刮擦以获得组织。 提取的材料在两个显微镜载玻片上展开。 样品在室温下干燥，然后用甲醇固定并用 Giemsa、Wright 或 Field 染色。 使用浸油，在带有 100X 镜头的显微镜下观察样品，评估利什曼原虫无鞭毛体的存在并验证其结构（细胞核、动质体和细胞膜）。 如果样本取自病变中心，则必须使用相同的止血技术，去除结痂，并使用解剖刀的锋利面彻底清洁溃疡底部，以防止出现细胞碎屑和/或化脓性物质. 必须继续此过程，直到在底部看到肉芽肿。 使用用于处理来自活动边缘的样本的相同技术，验证了利什曼原虫无鞭毛体的存在。

培养物取样技术

用于培养的样本可通过抽吸溃疡活动边缘或通过提取组织碎片，然后在含有抗生素（1000 UI 结晶青霉素/cc）的磷酸盐缓冲盐溶液 (PBS) 中浸渍，然后再进行培养。放入培养基中。 抽吸技术使用带有细针 (26G) 的结核菌素注射器，其中含有 0.3 cc 含抗生素的 PBS 溶液。 之前用 70% 的酒精对溃疡进行无菌处理，将针头插入真皮，通过旋转运动，针头斜面在大约一分钟内浸软少量组织，然后将其吸入注射器。 样品在无菌条件下放入 NNN 培养基中，并在 26ºC 下培养 4 周 [46,47]。 每周从培养基中提取一滴并置于两张载玻片之间，以便在显微镜下观察。 如果未发现前鞭毛体，培养物将被视为阴性 [46]。 使用 Diane Mc Mahon Pratt 博士开发的单克隆抗体 [48,49] 按物种鉴定菌株。

不良事件的评估和管理

在治疗和随访期间，将询问患者不良事件。 每个不良事件将由医生分类为严重或不严重（表 2 和 3）。 严重不良事件应符合以下一项或多项标准：

1. 死亡
2. 危及生命（即立即死亡的风险）
3. 住院治疗或延长现有住院治疗
4. 持续或显着残疾/无能力 存在危及患者生命和/或需要立即医疗或外科手术的严重不良事件将要求停止治疗并开始对患者进行相关医疗管理。 研究者将在得知任何严重不良事件后的 24 小时内将任何严重不良事件通知 FCV 的不良事件委员会 (AEC)。

非严重不良事件将分类如下：

1. 轻度：患者知道自己的症状和/或体征，但可以忍受。 他们不需要医疗干预或特殊治疗。
2. 中度：患者存在干扰其日常活动的问题。 他们需要医疗干预或特殊治疗。
3. 重度：患者无法工作或参加日常活动。 他们需要医疗干预或特殊治疗。

不良事件与受试药物之间的可能关系将由研究者根据他/她的临床判断和以下定义进行分类：

1. 绝对相关：事件可以通过受试药物的给药得到充分解释。
2. 可能相关：事件最有可能由受试药物的给药而非其他药物或患者的临床状态来解释。
3. 可能相关：事件可以用受试药物或其他药物的给药或患者的临床状态来解释。
4. 不相关：事件最有可能由患者的临床状态或其他药物来解释，而不是被测试的药物。

所有事件都将报告给 AEC，根据他们的标准，AEC 将决定患者是继续研究还是退出研究，从而决定是否破坏代码。

尽管该项目旨在将固有风险降至最低，但 AEC 将仔细评估与研究药物相关的任何不良事件，并且所需治疗产生的费用将由研究承担。

数据分析阶段

这个阶段将持续 6 个月。 在完成对 CFR 的所有数据输入后，将对结果进行审核，并由负责人评估和纠正检测到的错误。 信息将由两个不同的人输入到两个不同的数据库中，并且将比较记录以发现任何差异。 原始 CFR 将用于更正数据库中的任何错误。

对于统计分析，将使用 Stata 8.0。 描述性分析将根据变量的性质由中位数和比例及其各自的 95% 置信区间组成。 作为色散测量，将计算标准偏差。 将使用 Shapiro-Wilk 检验研究变量的分布。 为了检测组之间的任何差异，将根据其分布执行 T 检验或 Wilcoxon 检验。 分类变量将使用 Chi2 检验或精确 Fisher 检验进行比较。 如果需要，将进行多元逻辑回归模型或协方差分析。

当收集到 35% 和 70% 的计算样本时，将进行两次中期分析，目的是确定治疗方法之间的有效性和安全性差异。

端点

在研究结束时，将评估两个终点：

1. 成功治疗：

   1. 治疗开始三个月后完成再上皮化。
   2. 在研究的 6 个月期间，粘膜没有再激活和感染。

2. 治疗失败：

   1. 治疗开始三个月后不完全再上皮化。
   2. 与上次临床评估相比，溃疡面积增加超过 50%
   3. 在研究的 6 个月期间粘膜的重新激活和/或影响。

总结报告

在研究结束时，将对结果进行评估和讨论，并将最终报告提交给赞助该项目的实体 COLCIENCIAS。 相关结果将发表在国家和国际期刊上，并在大会和科学会议上发表。

道德方面

这项研究将根据赫尔辛基宣言和哥伦比亚卫生部第 8430/93 号决议的立法进行。 在研究患者入院之前，将解释目标和方法并获得知情同意。 该研究得到了哥伦比亚心血管基金会研究伦理委员会的批准（Act# 105/January 28/2005）。 患者的保密权将在研究的所有阶段得到维护。

利益争夺

非金融竞争利益

本手稿的作者声明他们没有竞争利益，包括政治、个人、宗教、意识形态、学术、知识或任何其他竞争利益。

金融竞争利益

在过去的五年里，我们没有收到任何组织的报销、费用、资金或薪水，这些组织可能会以任何方式从这份手稿的出版中获益或损失，无论是现在还是将来。 我们不持有任何可能因手稿出版而在现在或将来以任何方式获得或损失财务的组织的股票或股份。 我们不持有或目前正在申请与手稿内容相关的任何专利。 我们没有从持有或已申请与手稿内容相关的专利的组织那里收到报销、费用、资金或薪水。