Szabályozott nitrogén-oxid-leadó tapasz a meglumin antimoniáttal szemben a bőr leishmaniasis kezelésében

HÁTTÉR

A bőrleishmaniasis (CL) egy világméretű betegség, amely 88 országban endémiás [1]. Becslések szerint évente 1,5 millió ember szenved CL-ben, és több mint 350 millió embert fenyeget a fertőzés kockázata [2-4]. Amerikában évente 60 000 új CL-esetet jelentenek [5], amely 22 országból 20-ban és a Karib-tenger 2 szigetén endémiás [2]. Jelenleg a CL több mint 500, Irakban szolgáló amerikai hadsereg katonáját érinti [6]. Az Andok régióban a Leishmaniasis előfordulása drámaian megnőtt az elmúlt két évtizedben; 1996 és 1998 között évente több mint 14 000 eset [7]. Kolumbiában 6500 esetet jelentettek [8]. A bejelentett CL-esetek számának növekedése Kolumbiában olyan tényezőkkel függött össze, mint a migráció, az erdőirtás, az illegális ültetvények elszaporodása, a fegyveres politikai konfliktus és a vektor viselkedésbeli változásai. A kolumbiai Leishmania fő törzsei a L. panamensis, a L. brazilensis, a L. infantum és a L. guyanensis, amelyek az egész ország területén elterjedtek, túlnyomórészt a vidéki területeken [10]. A CL-t a Leishmania nemzetségbe tartozó intracelluláris protozoon paraziták okozzák [1], és az eddig besorolt ​​phlebotomus és lutzomyia homoklégyfajok kis százalékának harapása révén terjed az emberre [10]. A homoklegyek emésztőrendszerében ez a dimorf parazita egy extracelluláris flagellált formát mutat be, amelyet promastigótának neveznek, amely a gazdavérben való felszabadulás után a makrofágok által fagocitizálódik, elveszti flagelláját és amasztigótává alakul [12]. A kutyák, a rágcsálók és a didelphidae a parazita természetes gazdái, míg az ember mellékes gazdája [11]. Ez a zoonózis egy érdekes urbanizációs jelenséget szenvedett el, amely a főként aktív korú férfiakat érintő kiemelkedő vidéki entitásból olyan betegséggé vált, amely minden embert, különösen a gyermekeket érint [8,9]. A betegség jellegzetes elváltozásai az izolátumtól függően három hónaptól egy évig tartó spontán gyógyuló fekélyek, amelyek lapos, atrófiás és depigmentált heget hagynak hátra [13-15]. A CL, különösen az L. brazilensis által termelt mucocutan Leishmaniasis (MCL) alakulhat ki, amely elváltozásainak deformáló jellege miatt rosszabb prognózisú [16]. Ezen elváltozások spontán gyógyulása lehetővé teszi az újrafertőződéssel szembeni részleges rezisztencia megszerzését, ami megmagyarázhatja a gyermekek és fiatal felnőttek körében megfigyelt magasabb patogenitást [9]. Korábbi tanulmányok a CL gyakoribb előfordulását és a kezelésre adott rossz reakciót mutatták ki a gyermekpopulációban [17]. A kolumbiai járványügyi éberségi program előírja, hogy a lehetséges CL eseteket (a fekély jellemzői és a beteg eredete alapján azonosítják) a fekélyből vett szecessziós minta mikroszkópos közvetlen vizsgálatával igazolják, ha ezek negatívak, a seb biopsziájával. . A megerősítést követően az eseteket be kell jelenteni a helyi egészségügyi államtitkárnak a klinikai-epidemiológiai nyilvántartások segítségével. Ez a járványügyi éberséggel foglalkozó intézmény vizsgálja a fertőző forrásokat, és juttatja el a gyógyszereket az érintetteknek. Jelenleg számos szempontot figyelembe vesznek a CL kezelése során, amelyek közül az MCL kialakulásának kockázata, a léziók fokozata, lokalizációja, száma, mérete, kialakulása és perzisztenciája a legfontosabb [18]. Több mint 60 éve az ötértékű antimon vegyületeket, a nátrium-stiboglukonátot (Pentostan®, a Glaxo-Wellcome gyártja) és a meglumin antimoniátot (Glucantime®, a Sanofi-Aventis gyártja) tekintették a betegség választott kezelésének [19]. ]. A Kolumbiában végzett vizsgálatok 85%-os gyógyulási arányról számoltak be meglumin antimoniát alkalmazásával [20,21]. Annak ellenére, hogy ezeknek a gyógyszereknek a hatékonysága magas, számos hátránnyal járnak, mint például parenterális adagolás, és visszafordítható másodlagos hatások, mint hányinger, hányás, izom- és hasi fájdalom, szívproblémák, a máj aminotranszferáz-koncentrációjának emelkedése, ill. kémiai hasnyálmirigy-gyulladás [21,22]. Ezenkívül a kezelés betartását befolyásolja annak időtartama (több hét), elérhetőségét pedig az elosztási korlátozás. A második vonal terápiás alternatíváit javasolták; Az amfotericin B-t és a pentamidint kiváló eredménnyel alkalmazták, ennek ellenére magas költségük, kevés elérhetőségük, a betegek kórházi kezelésének szükségessége és másodlagos hatásuk súlyossága korlátozta alkalmazásukat [23,24]. Az elmúlt évtizedben új CL-kezeléseket fejlesztettek ki olyan orális szerekkel, mint a meflokin, itrakonazol, miltefozin, paromomicin, ketokonazol, allopurinol és dapson, azonban ezek hatékonysága nem bizonyult elégségesnek [19,21,25,26 ]. A CL helyi kezelésének kidolgozása érdekében a paromomicint különböző készítményekben alkalmazták. Azonban ezzel a gyógyszerrel elért gyógyulási arány nem volt magasabb, mint a hagyományos kezeléseknél, még a placebóval összehasonlítva sem [27,28]. Számos in vitro és in vivo vizsgálatban kimutatták, hogy a nitrogén-monoxid (NO) hatékonyan eltávolítja a Leishmania különböző törzseit amasztigóta formájában [29-35]. Az indukálható nitrogén-monoxid-szintáz (iNOS) által okozott L-arginin oxidációjából származó NO-termelés a makrofágok egyik legfontosabb védekező mechanizmusa [36], amelyben a Leishmania elleni védekezés két oxidatív formáját azonosították. A fertőzés első fázisában, válaszul a fagocitózis folyamatra, néhány promastigota eliminálódik a szuperoxid ion felszabadulásának köszönhetően, ezt a folyamatot a NADPH oxidáz katalizálja [29]. Azok a promastigóták, amelyek túlélik ezt a védekezési mechanizmust, amasztigótákká fejlődnek, aktiválják az IL-12 termelődését a makrofágokban, és elősegítik a Leishmania [29] antigének bemutatását a T helpers 1 limfociták számára, amelyek fokozzák a makrofágok citotoxikus aktivitását az intracelluláris felé. a paraziták a gamma-interferon (INFγ) és a tumor nekrózis faktor alfa (TNFα) révén az iNOS által katalizált NO termelésének elősegítésével [31-33]. Egy nemrégiben készült tanulmány az iNOS magasabb aktivitását mutatja a CL-vel fertőzött alanyok makrofágjaiban, ami arra utal, hogy az NO létfontosságú szerepet játszik a Leishmania elleni immunológiai aktivitásban [34]. A Leishmania fertőzésre (C57BL/6) rezisztens rágcsálókkal végzett vizsgálatokban, ahol L. majort, L. chagasi-t vagy L. donovani-t oltottak be, az iNOS-gátlók, mint például az NG-monometil-L-arginin (L-NMMA) alkalmazása magasabb növekedést okozott. a paraziták túlélési aránya és virulenciája a makrofágokban [33,35,37,38]. A Leishmania (BALB/C) fertőzés kialakulására genetikailag hajlamos L. major egerekbe történő beoltása után az iNOS aktivitását nem figyelték meg. Az IL-12 alkalmazása azonban képes volt kontrollálni a fertőzést az iNOS aktiválásával [31]. Embereken számos klinikai vizsgálatot végeztek NO-donorokat tartalmazó helyi kezelésekkel [39,40]. Ecuadorban csoportunk kifejlesztett és tesztelt egy NO-t generáló helyi krémet S-nitrozo-N-acetilpenicillamint (SNAP), amely jótékony hatást mutatott az ilyen típusú fekélyek kezelésében, és nem számoltak be súlyos mellékhatásokról. Ennek ellenére az instabil nitrogén-monoxid felszabadulás miatt a krémet gyakran (naponta 4-szer) kellett alkalmazni, ami megnehezítette a kezelés betartását [39]. Szíriában egy másik csoport szalicilsavval és aszkorbinsavval megsavanyított kálium-nitrátot használt a L. tropica helyi kezelésére [40]. In vitro ez a NO-képző keverék elpusztította a Leishmania amasztigótáit és promastigótáit; azonban in vivo a 40 beteg bevonásával végzett vizsgálat ellentmondásos eredményeket mutatott, az alanyok 28%-ánál csökkentette a fekély méretét, és csak 12%-uk gyógyult. Ezekben az eredményekben feltehetően az eltérés az NO előállítására alkalmazott technikának köszönhető. A nitrit savanyítása azonnali NO-robbanást eredményez, de felszabadulása nem marad fenn hosszú ideig [40]. Az NO felszabadulásának szabályozásának nehézségei szükségszerűvé tették annak szükségességét, hogy új technikákat keressünk a felszabadulás szabályozására. Az elektroszálas technikával előállított nanoszálas polimereket tanulmányozták annak érdekében, hogy garantálják a gyógyszerek folyamatos felszabadulását a lézión. Az elektrofonó eljárás során nagy feszültséget használnak elektromosan töltött polimer oldatsugara létrehozására, amely megszárad és megszilárdul, és száraz polimerszálat hagy maga után [41]. Ahogy ez a sugár a levegőben halad, az oldószer elpárolog, és egy töltött szálat hagy maga után, amely elektromosan eltéríthető, és egy fémernyőn összegyűjthető [42,43]. Különféle keresztmetszeti formájú és méretű szálakat állítanak elő különböző polimerekből. Ezzel a technikával számos gyógyszer, enzim és fehérje kapszulázása vagy bezárása sikeres volt. Egy korábbi tanulmányban a nanoszálas tapaszokat sikeresen használták a tetraciklin-hidroklorid felszabadítására. A tetraciklin felszabadulása 5 napig állandó volt [41;43]. Ugyanezzel a modellel egy többrétegű transzdermális tapaszt állítottak elő, amelyben a nitritet egy ioncserélő gyantához (DOWEX) kötik, és egy poliuretán nanoszálas rétegbe elektrofonálják. A nitrit-DOWEX réteg tetejére egy Waterlock® szuperabszorbenst és poliuretánt tartalmazó oldatot elektromos centrifugálással végeznek. A poliuretán oldatba zárt aszkorbinsavat egy harmadik rétegre elektromos fonással fonják fel, a negyedik és egyben utolsó réteg Waterlock® szuperabszorbens és poliuretán réteggel. Hidratáció után ez a nitrogén-oxidot felszabadító tapasz (NOP) 3,5 µmol NO stabil felszabadulását eredményezi 12 óra alatt [41,44,45]. A kolumbiai Santander állambeli Landazuriban kidolgozott kísérleti vizsgálatban placebo-kontrollos klinikai vizsgálatot végeztek 35 olyan beteggel, akiknél 68 L. panamensis által okozott fekély jelentkezett.A NOP alkalmazásával 65%-os javulást figyeltek meg a kezelt fekélyeknél, míg a placebo csoportban csak 25%-os javulást (p=0,001). Ebben a kísérleti vizsgálatban a leírt egyedi mellékhatás a viszketés volt azon a területen, ahol a tapaszt felhelyezték (nem publikált adatok). Figyelembe véve a CL széleskörű elterjedését, átviteli formájának változásait és a gyógyszerek hozzáférhetőségével kapcsolatos nehézségeket, ez a tanulmány azt javasolja megvizsgálni, hogy az elektrofonással előállított NO donor transzdermális tapasz legalább olyan hatékony-e, mint a meglumin antimoniát a CL kezelésére, kevesebb nemkívánatos eseménnyel és alacsonyabb költséggel, ezért hatékony terápiás alternatívát jelent. Abban az esetben, ha az NOP hatékonysága ebben a tanulmányban bizonyításra kerül, egy újszerű és biztonságos terápiás alternatíva válik elérhetővé hazánk egyik legfontosabb népegészségügyi problémájára, amely a könnyű hozzáférést és a magasabb adherenciát jelenti.

CÉLKITŰZÉSEK

Általános cél

A NOP hatékonyságának és biztonságosságának értékelése a CL kezelésében a meglumin antimoniáttal (Glucantime®) összehasonlítva.

Konkrét célkitűzések

1. A CL-fekélyek gyógyulási sebességének értékelése NOP segítségével, összehasonlítva az egészségügyi minisztérium által javasolt meglumin antimoniát kezelési tervvel.
2. A NOP alkalmazásával összefüggő nemkívánatos események azonosítása és összehasonlítása a meglumin antimoniát kezelés által okozott nemkívánatos eseményekkel.
3. A NOP és a meglumin antimoniát esetében előforduló visszaesések azonosítása és összehasonlítása.
4. Előrelépés a CL terápiás alternatívájának keresésében Kolumbiában.

TERVEZÉS

Kettős vak, randomizált, kettős maszkos, placebo-kontrollos klinikai vizsgálat, amely a nitrogén-monoxidot felszabadító tapaszokat a meglumin antimoniáttal hasonlította össze.

MINTA NAGYSÁGA

A mintát az arccosine képlet alapján számítottuk ki, 80%-os hatványt és 0,05%-os 1. típusú hibát alkalmazva. A meglumin antimoniát esetében 85%-os, a NOP esetében pedig 75%-os sikeres arány hozzárendelésével 558 betegre lesz szükség. Az 5%-os veszteségi rátára való kiigazítás után összesen 620 beteget kell toborozni (kezelési csoportonként 310 beteg).

NÉPESSÉG

A lakosság Kolumbia két régiójából fog állni. Az első egy endemikus zóna a kolumbiai Santanderben, a Magdalena-völgy és a Keleti-hegység között található, amely Landazuri, El Carmen, San Vicente, El Playon és Rionegro településeket foglalja magában. A második régió egy endemikus zóna Észak-Tolimában, amely magában foglalja Chaparral, San Antonio, Libano, Falan, Palocabildo és Mariquita településeket.

A BETEGEK KIVÁLASZTÁSA

Befogadási kritériumok

1. 18 és 50 év közötti férfiak és nők
2. Több mint két hete kialakult bőrfekélyek
3. Pozitív parazitológiai diagnózis a CL-re
4. Azok a betegek, akik önként vállalják, hogy részt vesznek a vizsgálatban, és aláírják a tájékozott beleegyező nyilatkozatot.
5. Hajlam arra, hogy minden látogatáson pontosan részt vegyenek (kezdeti, kezelés és utókezelés)
6. Annak elfogadása, hogy a vizsgálat ideje alatt nem alkalmaznak más kezelést a CL-re

Kizárási kritériumok

1. Terhes nők
2. Bármilyen állapot vagy betegség jelenléte, amely a beteget immunológiailag veszélyezteti (pl. cukorbetegség, rák stb.) vagy bármely más, amely a kutató megítélése alapján megváltoztathatja a CL lefolyását.
3. Diffúz CL vagy ötnél több aktív lézió.
4. Mucocutan leishmaniasis (az orr-, urogenitális és/vagy végbélnyálkahártyától vagy az ajkak szélétől nem lehet 2 cm-nél kisebb távolságra elváltozás).
5. Visceralis leishmaniasis
6. Teljes vagy nem teljes kezelés antimonvegyületekkel az elmúlt három hónapban.
7. Olyan betegek, akiknek a kórtörténetében máj-, vese- vagy szív- és érrendszeri betegség szerepel.
8. Mentális vagy neurológiai fogyatékos betegek, akiket nem tekintenek alkalmasnak arra, hogy jóváhagyják a vizsgálatban való részvételüket.

TANULMÁNYFEJLESZTÉS

Logisztikai fázis

Ez a szakasz 4 hónapig tart, és a következő tevékenységeket tartalmazza:

1. A vizsgálatban részt vevő személyzet képzése.
2. A projekt kidolgozásához szükséges anyagok beszerzése.
3. Szórólapok, promóciós és oktatóanyagok, eljárási kézikönyvek és esetjelentési űrlapok (CRF) készítése.
4. Kezelés randomizálása. A kezelés randomizálását a Kolumbiai Cardiovascular Foundation epidemiológusa fogja megvalósítani. Ezt a randomizálást blokkokban hajtják végre annak érdekében, hogy a kezelt csoportok mérete hasonló maradjon, elkerülhető legyen ugyanazon kezelés hosszú sorozata, és lehetőség szerint kiegyensúlyozzák az egyszerű randomizációs folyamatban rejlő torzításokat. Ezenkívül ez a blokkokban történő véletlenszerűsítés megkönnyíti az időközi elemzések végrehajtását.

Toborzási szakasz

Ez a szakasz 22 hónapot vesz igénybe. A kiválasztott településeken a kórházakban és egészségügyi központokban dolgozó egészségügyi dolgozók képzésben részesülnek a betegséggel és a vizsgálati módszertannal kapcsolatban. Ezzel egyidejűleg epidemiológiai fókuszvizsgálatot végeznek a közösség vezetőivel és az egészségügyi személyzettel a földrajzi és demográfiai viszonyok azonosítása céljából, azzal a céllal, hogy stratégiákat dolgozzanak ki a lehetséges leishmaniasis esetek toborzására. Ezt követően az egészségfejlesztők meghívják a szűrővizsgálatra azokat az alanyokat, akik több mint 2 hetes evolúcióval rendelkező aktív fekélyeket mutatnak, a CL parazitológiai igazolásával vagy anélkül (1. táblázat).

Szűrőlátogatás

A látogatás során teljes klinikai anamnézist készítenek, és adatokat szereznek a leishmaniasis előzményeiről (adott kezelés, lokalizáció, elváltozások száma stb.). A teljes körű orvosi kivizsgálás általánosan elfogadott technikák alapján történik. A felvételi/kizárási kritériumokat alkalmazzák, és a kiválasztott jelölteket tájékoztatják a vizsgálatról, majd aláírják a beleegyezésüket. Azon alanyok esetében, akiknél a fekélyek kialakulása több mint két hétig fennáll, parazitológiai diagnózis nélkül, a parazitológus közvetlen vizsgálatot végez. Ha az első közvetlen teszt negatív, azt legfeljebb háromszor meg kell ismételni; ezt követően negatív eredmény esetén biopsziát végeznek. Ha a leishmaniasis nem igazolódik be, a beteget az eredeti egészségügyi központba szállítják.

Kezdeti látogatás

A bevont betegek véletlenszerűen kerülnek besorolásra a két csoport egyikébe. Novy-Nicole-McNeal (NNN) tápközegben tenyészetet vesznek a törzs azonosításához, és vérmintát vesznek az antecubitalis vénából a májenzimek, a kreatinin és a hasnyálmirigy-amiláz meghatározásához. A vizit során teljes orvosi kivizsgálásra kerül sor, megmérik a fekélyt és leképeznek. A kép készítése előtt a fekély mellé egy osztásos szabályt helyezünk el, a résztvevő azonosító kódjával és a látogatás dátumával ellátott matricával együtt. Az első NOP-t (aktív vagy placebo) alkalmazzák a lézió lefedésére, és beadják az első meglumin-antimoniátot (aktív vagy placebót). A betegek tájékoztatást kapnak arról, hogyan ne sértsék meg a tapaszt, és hogyan azonosítsák és jelentsék a nemkívánatos eseményeket. Ennek elősegítése érdekében naplót kapnak a betegek nyilvántartására. A véletlenszerűen összeállított két csoportot a következőképpen osztjuk fel:

1. csoport: 20 napon keresztül ez a csoport egyidejűleg intramuszkuláris (IM) meglumin antimoniátot kap (Glucantime® 20 mg/kg/nap, maximum napi 3 ampulla adaggal); és egy NOP placebo.

2. csoport: 20 napon keresztül ez a csoport egyszerre kap placebót IM meglumin antimoniátból (5-15 cm3/nap) és aktív NOP-t.

Kezelési látogatások

A betegek 20 napon keresztül naponta felkeresik az egészségügyi központot, hogy megkapják mind a NOP-t (placebo vagy aktív), mind a meglumin antimoniátot (placebo vagy aktív). Naponta felmérik az alanyokat és a kezeléshez való ragaszkodásukat, és összegyűjtik az adatokat. Ha bármilyen nemkívánatos eseményt észlelnek, a beteget azonnal az egészségügyi személyzethez irányítják, aki elvégzi az értékelést, és jelenti azt a nemkívánatos eseményekkel foglalkozó bizottságnak, amely minden esetben meghozza a végső döntést.

Nyomon követési látogatások

Ez a szakasz 10 hónapig tart. A nyomon követés során a betegeket 4 alkalommal látja majd a kutatócsoport. Az első látogatásra a kezelés befejezését követő napon (21. nap) kerül sor, melynek során új vérmintákat vesznek biokémiai meghatározáshoz. A második, harmadik és negyedik látogatás a 45., a 90. és a 180. napon valósul meg. A látogatások során felmérik a fekély gyógyulási folyamatát, a visszaesések és/vagy újrafertőződések jelenlétét, valamint a résztvevők egészségi állapotát. A fekélyek evolúcióját fényképen rögzítik.

A fekély maximális és minimális átmérőjét osztásos vonalzóval, a keményedést pedig golyóstoll-technikával mérjük. A fekély és a keményedés területét külön számítják ki, majd regisztrálják a CRF-ben. A klinikai válasz értékelése azon a fekélyen alapul, amely a legkevésbé javult.

1. Teljes klinikai válasz: A fekély teljes reepitelizációja és a keményedés eltűnése.
2. Klinikai javulás: A fekély és az indurációs területek több mint 50%-ának csökkentése az utolsó klinikai értékeléshez képest.
3. Klinikai válasz hiánya: A fekély és a bekeményedési területek kevesebb mint 50%-os növekedése vagy csökkenése az utolsó klinikai értékeléshez képest.

4. Terápiás kudarc:

   1. A fekély méretének több mint 50%-os növekedése az utolsó klinikai értékeléshez képest
   2. A fekély jelenléte három hónappal a kezelés megkezdése után.
   3. Reaktiváció: Elváltozás megjelenése a heg szélén vagy közepén, pozitív parazitológiai diagnózissal, teljes reepitelizációt követően.
   4. Nyálkahártya-érzékelés: Nyálkahártya-érzékelések jelenléte a kezelés alatt, annak végén vagy az utóvizsgálatok alkalmával.
5. Újrafertőzés: Fekély aktiválása az eredeti léziótól eltérő területen.

Azoknál az alanyoknál, akiknek a kezelését sikertelennek minősítették, a kód feltörik, és átküldik őket eredeti egészségügyi központjukba, hogy más terápiás megközelítést keressenek.

Eljárások

Fizikális vizsgálat

Teljes fizikális vizsgálatot hajtanak végre, és megmérik az életjeleket.

Vérminták visszavonva

Vérmintákat vesznek az antecubitalis vénából a következő biokémiai elemzések elvégzéséhez:

1. Kreatinin spektrofotometriával
2. Alanin transzamináz (ALT) spektrofotometriával
3. Aszpartát transzamináz (AST) spektrofotometriával
4. Hasnyálmirigy-amiláz spektrofotometriával

Mintavételi technika a CL közvetlen vizsgálatához

Közvetlen tesztet végeznek az amasztigótákat tartalmazó sejtek jelenlétének megerősítésére a dermisz kaparásában[46,47]; a mintának, amennyire lehetséges, vértől, sejttörmeléktől vagy gennytől mentesnek kell lennie. Ha a betegek több elváltozást mutatnak, akkor a legrövidebb evolúciós idővel, legnagyobb indurációs területtel és/vagy legkevésbé gennyes váladékkal rendelkezőből kell mintát venni. Ha a lézión varasodás van, azt el kell távolítani a minta minőségének javítása érdekében. A minta a fekély aktív széléről vagy aljáról vehető. Amikor a mintát az aktív élről veszik, az aszepszist 70%-os alkohollal kell megvalósítani, majd az első és második ujjal vérzéscsillapítást kell végezni, hogy megbizonyosodjon arról, hogy nincs vér a mintában. A fekély szélével párhuzamosan egy kis, körülbelül 3 mm hosszúságú és mélységű bemetszést egy szikével végeznek az aktív élen. A szike éles oldalával egy kaparást végeznek a bemetszés dermikus falán, hogy szövetet nyerjenek. A kivont anyagot két mikroszkóp tárgylemezen meghosszabbítják. A mintát szobahőmérsékleten szárítjuk, majd metanollal rögzítjük, és Giemsa, Wright vagy Field festékkel festjük. Immerziós olaj felhasználásával a mintát mikroszkóp alatt, 100-szoros lencsével figyeljük meg, értékeljük a Leishmania amasztigóták jelenlétét és igazoljuk szerkezetüket (mag, kinetoplaszt és sejtmembrán). Ha a mintát a lézió közepéről veszik, ugyanazt a vérzéscsillapító technikát kell alkalmazni, a varasodást el kell távolítani, és a fekély alját alaposan meg kell tisztítani a szike éles oldalával, hogy megakadályozzák a sejttörmelék és/vagy gennyes anyag jelenlétét. . Ezt az eljárást addig kell folytatni, amíg a granulomák meg nem jelennek az alján. Ugyanazzal a technikával, mint a minták aktív éléről történő feldolgozásakor, igazoljuk a Leishmania amasztigóták jelenlétét.

A tenyészetek mintavételi technikája

A tenyészethez szükséges mintát a fekély aktív szélének leszívásával vagy egy szövetrészlet extrahálásával nyerhetjük ki, amelyet ezután foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) macerálnak antibiotikumokkal (1000 UI kristályos penicillin cc), mielőtt felszívják. helyezzük a táptalajba. A leszívási technikához vékony tűvel (26G) ellátott tuberkulin fecskendőt használnak, amely 0,3 cc antibiotikus PBS-oldatot tartalmaz. A fekély korábbi aszepszisa 70%-os alkohollal a bőrbe egy tűt vezetnek be, majd forgó mozdulatokkal egy kis mennyiségű szövetet a tű ferdén macerálnak kb. egy perc alatt, majd beszívják a fecskendőbe. A mintát aszeptikus körülmények között NNN táptalajba helyezzük, és 26ºC-on 4 hétig inkubáljuk [46,47]. Minden héten kivonnak egy cseppet a táptalajból, és két tárgylemez közé helyezik, hogy mikroszkóp alatt megfigyeljék. Abban az esetben, ha a promastigoták nem találhatók, a tenyészeteket negatívként elutasítják [46]. A törzseket fajok szerint azonosítják a Dr. Diane Mc Mahon Pratt által kifejlesztett monoklonális antitestek segítségével [48,49].

Nemkívánatos események értékelése és kezelése

A kezelés és az utóvizsgálatok során a betegeket megkérdezik a nemkívánatos eseményekről. Az orvos minden nemkívánatos eseményt súlyosnak vagy nem súlyosnak minősít (2. és 3. táblázat). Egy súlyos nemkívánatos eseménynek meg kell felelnie egy vagy több alábbi kritériumnak:

1. Halál
2. Életveszélyes (azaz azonnali halálveszély)
3. Fekvőbeteg-hospitálás vagy a meglévő kórházi kezelés meghosszabbítása
4. Tartós vagy jelentős rokkantság/képtelenség A beteg életét veszélyeztető és/vagy azonnali orvosi vagy sebészeti beavatkozást igénylő súlyos nemkívánatos esemény jelenléte a kezelés leállítását és a betegek megfelelő orvosi kezelésének megkezdését teszi szükségessé. A vizsgáló minden súlyos nemkívánatos eseményről 24 órán belül értesíti az FCV Nemkívánatos Események Bizottságát (AEC).

A nem súlyos nemkívánatos eseményeket a következőképpen kell besorolni:

1. Enyhe: A betegek tisztában vannak tüneteikkel és/vagy jeleikkel, de ezek elviselhetők. Nem igényelnek orvosi beavatkozást vagy speciális kezelést.
2. Mérsékelt: A betegek olyan problémákkal küzdenek, amelyek zavarják napi tevékenységeiket. Orvosi beavatkozást vagy speciális kezelést igényelnek.
3. Súlyos: A betegek nem tudnak dolgozni vagy részt venni napi tevékenységeikben. Orvosi beavatkozást vagy speciális kezelést igényelnek.

A nemkívánatos események és a vizsgált gyógyszer közötti lehetséges kapcsolatot a vizsgáló osztályozza klinikai megítélése és a következő definíciók alapján:

1. Határozottan kapcsolódó: Az esemény teljes mértékben megmagyarázható a vizsgált gyógyszer beadásával.
2. Valószínűleg összefügg: Az esemény leginkább a vizsgált gyógyszer beadásával magyarázható, nem pedig más gyógyszerekkel, vagy a páciens klinikai állapotával.
3. Lehetséges összefüggés: Az esemény a vizsgált gyógyszer vagy más gyógyszer beadásával vagy a beteg klinikai állapotával magyarázható.
4. Nem kapcsolódik: Az eseményt leginkább a páciens klinikai állapota vagy más gyógyszerei magyarázzák, nem pedig a tesztelt.

Minden eseményt jelenteni fognak az AEC-nek, amely kritériumaitól függően dönt a vizsgálat folytonosságáról vagy a betegnek a vizsgálatból való visszavonásáról, és ezáltal a kód feltöréséről.

Bár a projektet úgy alakították ki, hogy minimalizálja a benne rejlő kockázatokat, a vizsgálati gyógyszerekkel kapcsolatos minden nemkívánatos eseményt az AEC gondosan értékel, és a szükséges kezelés költségeit a vizsgálat fedezi.

Adatelemzési szakasz

Ez a szakasz 6 hónapig tart. A CFR-be történő összes adatbevitel elvégzése után az eredményeket auditálja és a feltárt hibákat a felelős értékeli és kijavítja. Az információkat két különböző személy fogja bevinni két különböző adatbázisba, és a rekordokat összehasonlítják az esetleges eltérések észlelése érdekében. Az adatbázisban lévő hibák kijavításához az eredeti CFR-t használjuk fel.

A statisztikai elemzéshez a Stata 8.0-t használjuk. A leíró elemzés a változók természetének megfelelő mediánokból és arányokból áll, a megfelelő 95%-os konfidencia intervallumokkal. Szórásmérésként a szórást számítjuk ki. A változók eloszlását a Shapiro-Wilk teszt segítségével vizsgáljuk. A csoportok közötti különbségek kimutatásához T-tesztet vagy Wilcoxon-tesztet kell végezni annak eloszlásától függően. A kategorikus változókat a Chi2 teszt vagy a pontos Fisher teszt segítségével hasonlítjuk össze. Szükség esetén többszörös logisztikus regressziós modellt vagy kovarianciaanalízist készítenek.

A számított minta 35%-ának és 70%-ának begyűjtésekor két időközi elemzést végeznek azzal a céllal, hogy meghatározzák a kezelések hatékonyságában és biztonságosságában mutatkozó különbségeket.

Végpontok

A vizsgálat végén két végpont kerül értékelésre:

1. Sikeres kezelés:

   1. Teljes reepitelizáció három hónappal a kezelés megkezdése után.
   2. Reaktiváció és nyálkahártya-érzések hiánya a vizsgálat 6 hónapja alatt.

2. A kezelés sikertelensége:

   1. Hiányos reepitelizáció három hónappal a kezelés megkezdése után.
   2. A fekély méretének több mint 50%-os növekedése az utolsó klinikai értékeléshez képest
   3. A nyálkahártyák reaktivációja és/vagy érzékenysége a vizsgálat 6 hónapja alatt.

Zárójelentés

A tanulmány végén az eredményeket értékelik és megvitatják, majd a zárójelentést bemutatják a projektet támogató COLCIENCIAS-nak. A vonatkozó eredményeket hazai és nemzetközi folyóiratokban is publikálják, és kongresszusokon és tudományos üléseken mutatják be.

ETIKAI SZEMPONTOK

Ezt a tanulmányt a Helsinki Nyilatkozatnak és a kolumbiai jogszabályoknak megfelelően, az Egészségügyi Minisztérium 8430/93. számú határozata értelmében hajtják végre. A betegek vizsgálatba vétele előtt elmagyarázzák a célokat és a módszertant, és megkapják a tájékozott beleegyezést. A tanulmányt a Kolumbiai Kardiovaszkuláris Alapítvány Kutatási Etikai Bizottsága hagyta jóvá (105. sz. törvény/2005. január 28.). A betegek bizalmas kezeléséhez való jogát a vizsgálat minden szakaszában fenntartják.

VERSENY ÉRDEKEK

Nem pénzügyi versengő érdekek

A kézirat szerzői kijelentik, hogy nincsenek egymással versengő érdekeik, ideértve a politikai, személyes, vallási, ideológiai, tudományos, szellemi vagy bármilyen más versengő érdeket.

Pénzügyi versengő érdekek

Az elmúlt öt évben nem kaptunk visszatérítést, díjakat, finanszírozást vagy fizetést egyetlen olyan szervezettől sem, amely bármilyen módon nyerhetne vagy veszíthetne e kézirat megjelenésével, sem most, sem a jövőben. Nem rendelkezünk részvényekkel vagy részvényekkel olyan szervezetben, amely bármilyen módon nyerhet vagy veszíthet a kézirat közzétételéből, akár most, akár a jövőben. Nem birtokolunk és jelenleg sem kérelmezünk a kézirat tartalmával kapcsolatos szabadalmat. Nem kaptunk visszatérítést, díjakat, finanszírozást vagy fizetést olyan szervezettől, amely a kézirat tartalmával kapcsolatos szabadalmat birtokolja vagy kérte.