Beoordeling van serum- en weefselniveaus van door koude induceerbaar RNA-bindend eiwit bij patiënten met Lichen Planus

De doelstellingen van deze studie zijn:

• Beoordeling van serum- en weefselniveaus van CIRP bij patiënten met LP.
• Om serum- en weefselniveaus van CIRP te vergelijken bij patiënten met LP en gezonde controles.

• Om CIRP-niveaus te vergelijken op basis van de ernst van LP. Er zal een cross-sectioneel onderzoek worden uitgevoerd bij 40 patiënten met LP en 40 gezonde controlepersonen die qua leeftijd en geslacht overeenkomen. De diagnose van LP zal klinisch zijn en zal worden bevestigd door dermoscopie.

  • Methoden van het onderzoek:

    1. Evaluatie van CIRP-expressie:

       Elke deelnemer aan dit onderzoek zal in dezelfde sessie worden onderworpen aan zowel bloedafname als huidbiopsie. Vervolgens wordt elk monster afzonderlijk en blind verwerkt op de afdelingen Klinische Pathologie en Histologie, als volgt:

• Bloedafname:

Van elk van de twee onderzochte groepen wordt in een gratis antistollingsbuisje drie ml veneus bloed afgenomen, waardoor het bloed kan worden gestold. Nadat de buis 30 minuten bij kamertemperatuur is gelaten tot coagulatie, worden de monsters gecentrifugeerd (bij 3000 rpm gedurende 15 minuten) en wordt het resulterende serum tot het testen bij -80°C bewaard (22). Serum-CIRP-niveaus zullen worden gemeten met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbentanalyse-analyse (ELISA)-kit.

• Huidbiopten: Van elke patiënt en controle wordt één huidbiopsie genomen met een punch van 3 mm. Deze biopsieën zullen onder plaatselijke verdoving worden genomen van LP-laesies en dezelfde gebieden die bij de controle overeenkomen. Alle biopsieën worden ingediend bij de afdeling Histologie van de medische faculteit van Sohag. Ze worden gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline, gedehydrateerd in ethanol van oplopende kwaliteit, gevolgd door onderdompeling in xyleen en vervolgens geïmpregneerd in paraffine. Van elk blok worden verschillende secties van 5 micron (5um) dik genomen. Eén objectglaasje wordt gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) voor routinematig histopathologisch onderzoek. Andere secties zullen op positief geladen objectglaasjes worden gemonteerd en bij kamertemperatuur worden bewaard om immunohistochemisch te worden gekleurd.

1. Histopathologische beoordeling van H&E-gekleurde coupes:

   Secties gekleurd met H&E zullen worden geëvalueerd onder de lichtmicroscoop om de diagnose van LP te bevestigen en om epidermale en dermale veranderingen te beoordelen.

2. Immunohistochemische (IHC) kleuringsprocedure De methode die wordt gebruikt voor immunokleuring zal een streptavidine-biotine-geamplificeerd systeem zijn. In paraffine ingebedde weefselcoupes worden van paraffine ontdaan in xyleen, gerehydrateerd in een gegradeerde reeks ethanol en geïncubeerd met 3% waterstofperoxide. De objectglaasjes worden gespoeld in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en vervolgens gedurende 20 minuten blootgesteld aan door hitte geïnduceerde epitoopwinning in citraatbufferoplossing (Ph 6). Na afkoelen worden de objectglaasjes een nacht bij kamertemperatuur geïncubeerd met monoklonaal anti-CIRP-antilichaam van muizen (0,1 ml geconcentreerd en verdund met PBS in een verdunning van 1:75). Detectie van immunoreactiviteit zal worden uitgevoerd met behulp van het Universal Labeled Streptavidin-Biotin-systeem, mierikswortelperoxidase. Ten slotte zal de reactie worden gevisualiseerd door een geschikt substraat/chromogeen (diaminobenzidine) reagens. De kleuringsprocedure omvat de negatieve controles die worden verkregen door vervanging van primaire antilichamen door fosfaatgebufferde zoutoplossing (16).
3. Interpretatie van CIRP-immunokleuring:

De CIRP-immunokleuring zal afzonderlijk en blind worden beoordeeld bij LP-laesie- en controlegevallen. Epidermale en dermale cellen zullen positief worden beoordeeld door de aanwezigheid van bruinachtige verkleuring gedetecteerd door DAB-reactie, hetzij in het cytoplasma of in de kernen van ≥ 1 gekleurde cellen (25).