Ocena poziomu białek wiążących RNA indukowanych zimnem w surowicy i tkankach u pacjentów z liszajem płaskim

Celem tego badania jest:

• Ocena poziomu CIRP w surowicy i tkankach u pacjentów z LP.
• Porównanie poziomów CIRP w surowicy i tkankach u pacjentów z LP i zdrową grupą kontrolną.

• Aby porównać poziomy CIRP według ciężkości LP. Badanie przekrojowe zostanie przeprowadzone z udziałem 40 pacjentów z LP i 40 zdrowych osób z grupy kontrolnej dobranych pod względem wieku i płci. Rozpoznanie LP zostanie przeprowadzone klinicznie i zostanie potwierdzone za pomocą dermoskopii.

  • Metody badania:

    1. Ocena ekspresji CIRP:

       Każdy uczestnik tego badania zostanie poddany zarówno pobraniu krwi, jak i biopsji skóry podczas tej samej sesji, a następnie każda próbka zostanie zbadana oddzielnie i na ślepo w Oddziałach Patologii Klinicznej i Histologii w następujący sposób:

• Pobieranie próbek krwi:

Od każdej z dwóch badanych grup zostanie pobrana próbka krwi żylnej o pojemności 3 ml, do darmowej probówki z antykoagulantem, umożliwiającej koagulację krwi. Po 30 minutach pozostawienia probówki w temperaturze pokojowej do czasu koagulacji, próbki zostaną odwirowane (przy 3000 obr./min przez 15 minut), a uzyskana surowica będzie przechowywana w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia badania (22). Poziomy CIRP w surowicy będą mierzone przy użyciu zestawu do analizy immunoenzymatycznej (ELISA).

• Biopsje skóry: Od każdego pacjenta i grupy kontrolnej zostanie pobrana jedna biopsja skóry z 3 mm stemplem. Biopsje te zostaną pobrane w znieczuleniu miejscowym ze zmian LP i tych samych obszarów odpowiadających kontroli. Wszystkie biopsje zostaną przesłane do Zakładu Histologii Wydziału Lekarskiego Sohag. Zostaną utrwalone w 10% obojętnej buforowanej formalinie, odwodnione w rosnących stopniach etanolu, następnie zanurzone w ksylenie, a następnie impregnowane w parafinie. Z każdego bloku zostanie pobranych kilka skrawków o grubości 5 mikronów (5um). Jeden preparat zostanie wybarwiony hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu rutynowego badania histopatologicznego. Inne skrawki zostaną umieszczone na szkiełkach naładowanych dodatnio i przechowywane w temperaturze pokojowej w celu wybarwienia immunohistochemicznego.

1. Ocena histopatologiczna skrawków barwionych H&E:

   Skrawki zabarwione H&E zostaną ocenione pod mikroskopem świetlnym w celu potwierdzenia diagnozy LP oraz oceny zmian naskórkowych i skórnych.

2. Procedura barwienia immunohistochemicznego (IHC) Metodą stosowaną do barwienia immunologicznego będzie układ amplifikowany streptawidyna-biotyna. Skrawki tkanek zatopione w parafinie zostaną odparafinowane w ksylenie, ponownie uwodnione w stopniowanej serii etanolu i inkubowane z 3% nadtlenkiem wodoru. Szkiełka zostaną przepłukane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie wystawione na wywołane ciepłem odzyskiwanie epitopów w roztworze buforu cytrynianowego (Ph 6) przez 20 minut. Po ochłodzeniu szkiełka będą inkubowane przez noc w temperaturze pokojowej z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-CIRP (0,1 ml zatężony i rozcieńczony PBS w rozcieńczeniu 1:75). Wykrywanie immunoreaktywności zostanie przeprowadzone przy użyciu systemu Universal Labeled Streptavidin-Biotin, peroksydaza chrzanowa. Na koniec reakcję można uwidocznić za pomocą odpowiedniego odczynnika substrat/chromogen (diaminobenzydyna). Procedura barwienia będzie obejmować kontrole negatywne uzyskane przez podstawienie przeciwciał pierwszorzędowych solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (16).
3. Interpretacja barwienia immunologicznego CIRP:

Barwienie immunologiczne CIRP będzie oceniane oddzielnie i na ślepo w przypadku zmian LP i przypadkach kontrolnych. Komórki naskórka i skóry właściwej zostaną uznane za pozytywne na podstawie obecności brązowawego zabarwienia wykrytego w reakcji DAB w cytoplazmie lub jądrach w ≥ 1 wybarwionych komórkach (25).