Valutazione dei livelli sierici e tissutali della proteina legante l'RNA inducibile dal freddo in pazienti con lichen planus

Gli obiettivi di questo studio sono:

• Valutazione dei livelli sierici e tissutali di CIRP in pazienti con LP.
• Confrontare i livelli sierici e tissutali di CIRP in pazienti con LP e controlli sani.

• Per confrontare i livelli CIRP in base alla gravità LP. Verrà condotto uno studio trasversale su 40 pazienti con LP e 40 controlli sani abbinati per età e sesso. La diagnosi di LP sarà clinica e sarà confermata mediante dermatoscopia.

  • Metodi dello studio:

    1. Valutazione dell'espressione CIRP:

       Ogni partecipante a questo studio sarà sottoposto sia al prelievo di sangue che alla biopsia cutanea nella stessa sessione, quindi ciascun campione verrà elaborato separatamente e in cieco presso i dipartimenti di Patologia Clinica e Istologia come segue:

• Prelievo di sangue:

Da ciascuno dei due gruppi studiati verranno prelevati 3 ml di sangue venoso in una provetta libera con anticoagulante, che consentirà la coagulazione del sangue. Dopo aver lasciato la provetta per 30 minuti a temperatura ambiente fino alla coagulazione, i campioni verranno centrifugati (a 3000 giri/min per 15 minuti) e il siero risultante verrà conservato a -80°C fino al momento del test (22). I livelli sierici di CIRP saranno misurati utilizzando un kit di analisi ELISA (enzima-linked immunosorbent assay analysis).

• Biopsie cutanee: verrà eseguita una biopsia cutanea con un punch da 3 mm per ciascun paziente e controllo. Queste biopsie verranno effettuate in anestesia locale dalle lesioni dell'LP e dalle stesse aree abbinate al controllo. Tutte le biopsie saranno inviate al Dipartimento di Istologia, Facoltà di Medicina di Sohag. Saranno fissati in formalina tamponata neutra al 10%, disidratati in gradi ascendenti di etanolo seguita da immersione in xilene e quindi impregnati in paraffina. Verranno prelevate diverse sezioni spesse 5 micron (5um) da ciascun blocco. Un vetrino verrà colorato con ematossilina ed eosina (H&E) per l'esame istopatologico di routine. Altre sezioni verranno montate su vetrini caricati positivamente e conservate a temperatura ambiente per essere colorate immunoistochimicamente.

1. Valutazione istopatologica delle sezioni colorate con H&E:

   Le sezioni colorate con H&E saranno valutate al microscopio ottico per confermare la diagnosi di LP e valutare i cambiamenti epidermici e dermici.

2. Procedura di colorazione immunoistochimica (IHC) Il metodo utilizzato per l'immunocolorazione sarà il sistema amplificato streptavidina-biotina. Le sezioni di tessuto incluse in paraffina verranno deparaffinate in xilene, reidratate in una serie graduata di etanolo e incubate con perossido di idrogeno al 3%. I vetrini verranno sciacquati in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e quindi esposti al recupero degli epitopi indotto dal calore in soluzione tampone citrato (Ph 6) per 20 minuti. Dopo il raffreddamento, i vetrini verranno incubati per una notte a temperatura ambiente con anticorpo monoclonale murino anti-CIRP (0,1 ml concentrato e diluito con PBS in una diluizione 1:75). La rilevazione dell'immunoreattività sarà effettuata utilizzando il sistema streptavidina-biotina marcato universale, perossidasi di rafano. Infine, la reazione verrà visualizzata mediante un opportuno reagente substrato/cromogeno (diaminobenzidina). La procedura di colorazione includerà i controlli negativi ottenuti mediante sostituzione degli anticorpi primari con soluzione salina tamponata con fosfato (16).
3. Interpretazione dell'immunocolorazione CIRP:

L'immunocolorazione CIRP sarà valutata separatamente e in cieco nella lesione LP e nei casi di controllo. Le cellule epidermiche e dermiche verranno assegnate come positive in base alla presenza di colorazione brunastra rilevata mediante reazione DAB nel citoplasma o nei nuclei in ≥ 1 cellule colorate (25).