Beurteilung der Serum- und Gewebespiegel von kälteinduzierbarem RNA-bindendem Protein bei Patienten mit Lichen planus

Die Ziele dieser Studie sind:

• Beurteilung der Serum- und Gewebespiegel von CIRP bei Patienten mit LP.
• Vergleich der Serum- und Gewebespiegel von CIRP bei Patienten mit LP und gesunden Kontrollpersonen.

• Vergleich der CIRP-Werte nach LP-Schweregrad. Eine Querschnittsstudie wird an 40 Patienten mit LP und 40 gesunden Kontrollpersonen gleichen Alters und Geschlechts durchgeführt. Die Diagnose einer LP wird klinisch gestellt und durch Dermatoskopie bestätigt.

  • Methoden der Studie:

    1. Auswertung der CIRP-Expression:

       Bei jedem Teilnehmer dieser Studie wird in derselben Sitzung sowohl eine Blutentnahme als auch eine Hautbiopsie durchgeführt. Anschließend wird jede Probe separat und blind in den Abteilungen für klinische Pathologie und Histologie wie folgt verarbeitet:

• Blutprobe:

Von jeder der beiden untersuchten Gruppen werden 3 ml venöses Blut in einem freien Antikoagulansröhrchen entnommen, um die Gerinnung des Blutes zu ermöglichen. Nachdem das Röhrchen 30 Minuten lang bis zur Koagulation bei Raumtemperatur belassen wurde, werden die Proben zentrifugiert (bei 3000 U/min für 15 Minuten) und das resultierende Serum bis zum Test bei -80 °C gelagert (22). Die CIRP-Spiegel im Serum werden mithilfe eines ELISA-Kits (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Analysis) gemessen.

• Hautbiopsien: Von jedem Patienten und jeder Kontrollperson wird eine Hautbiopsie mit einer 3-mm-Stanze entnommen. Diese Biopsien werden unter örtlicher Betäubung aus LP-Läsionen entnommen und in den gleichen Bereichen wie bei der Kontrolle abgeglichen. Alle Biopsien werden an die Histologieabteilung der Medizinischen Fakultät Sohag übermittelt. Sie werden in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert, in aufsteigendem Ethanol dehydriert, anschließend in Xylol getaucht und dann in Paraffin imprägniert. Von jedem Block werden mehrere 5 Mikrometer (5 µm) dicke Schnitte entnommen. Ein Objektträger wird zur routinemäßigen histopathologischen Untersuchung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Andere Schnitte werden auf positiv geladene Objektträger montiert und bei Raumtemperatur gelagert, um immunhistochemisch gefärbt zu werden.

1. Histopathologische Beurteilung von H&E-gefärbten Schnitten:

   Mit H&E gefärbte Schnitte werden unter dem Lichtmikroskop ausgewertet, um die Diagnose von LP zu bestätigen und epidermale und dermale Veränderungen zu beurteilen.

2. Immunhistochemisches (IHC) Färbeverfahren Die für die Immunfärbung verwendete Methode ist das Streptavidin-Biotin-amplifizierte System. In Paraffin eingebettete Gewebeschnitte werden in Xylol entparaffiniert, in einer abgestuften Reihe von Ethanol rehydratisiert und mit 3 % Wasserstoffperoxid inkubiert. Die Objektträger werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann 20 Minuten lang einer hitzeinduzierten Epitopentfernung in Citratpufferlösung (Ph 6) ausgesetzt. Nach dem Abkühlen werden die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur mit monoklonalem Maus-Anti-CIRP-Antikörper (0,1 ml konzentriert und mit PBS in einer Verdünnung von 1:75 verdünnt) inkubiert. Der Nachweis der Immunreaktivität erfolgt mithilfe des Universal Labeled Streptavidin-Biotin-Systems, Meerrettichperoxidase. Abschließend wird die Reaktion durch ein geeignetes Substrat/Chromogen (Diaminobenzidin)-Reagenz sichtbar gemacht. Das Färbeverfahren umfasst die Negativkontrollen, die durch Substitution der Primärantikörper durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung erhalten werden (16).
3. Interpretation der CIRP-Immunfärbung:

Die CIRP-Immunfärbung wird in LP-Läsions- und Kontrollfällen separat und blind beurteilt. Epidermale und dermale Zellen werden durch das Vorhandensein einer bräunlichen Färbung, die durch die DAB-Reaktion entweder im Zytoplasma oder in den Zellkernen in ≥ 1 gefärbten Zellen nachgewiesen wird, als positiv eingestuft (25).