Avaliação dos níveis séricos e teciduais de proteína de ligação ao RNA induzível pelo frio em pacientes com líquen plano

Os objetivos deste estudo são:

• Avaliação dos níveis séricos e teciduais de CIRP em pacientes com LP.
• Comparar os níveis séricos e teciduais de CIRP em pacientes com LP e controles saudáveis.

• Comparar os níveis de CIRP de acordo com a gravidade da LP. Um estudo transversal será realizado em 40 pacientes com LP e 40 controles saudáveis ​​pareados por idade e sexo. O diagnóstico de LP será clínico e confirmado por dermatoscopia.

  • Métodos do estudo:

    1. Avaliação da expressão CIRP:

       Cada participante deste estudo será submetido a coleta de sangue e biópsia de pele na mesma sessão, então cada amostra será processada separadamente e às cegas nos Departamentos de Patologia Clínica e Histologia da seguinte forma:

• Amostra de sangue:

Serão coletadas amostras de três ml de sangue venoso de cada um dos dois grupos estudados em tubo anticoagulante livre, permitindo a coagulação do sangue. Após 30 minutos deixando o tubo em temperatura ambiente até a coagulação, as amostras serão centrifugadas (a 3000 rpm por 15 min) e o soro resultante será armazenado a -80°C até o teste (22). Os níveis séricos de CIRP serão medidos usando um kit de análise de ensaio imunoenzimático (ELISA).

• Biópsias de pele: Uma biópsia de pele será realizada com punch de 3 mm de cada paciente e controle. Essas biópsias serão realizadas sob anestesia local nas lesões LP e nas mesmas áreas correspondentes no controle. Todas as biópsias serão submetidas ao Departamento de Histologia da Faculdade de Medicina de Sohag. Serão fixados em formalina tamponada neutra a 10%, desidratados em graus crescentes de etanol seguido de imersão em xileno e posteriormente impregnados em parafina. Serão retiradas várias seções de 5 mícrons (5um) de espessura de cada bloco. Uma lâmina será corada por hematoxilina e eosina (H&E) para exame histopatológico de rotina. Outras seções serão montadas em lâminas com carga positiva e armazenadas em temperatura ambiente para serem coradas imuno-histoquimicamente.

1. Avaliação histopatológica de cortes corados com H&E:

   Os cortes corados com H&E serão avaliados ao microscópio óptico para confirmar o diagnóstico de LP e avaliar alterações epidérmicas e dérmicas.

2. Procedimento de coloração imunohistoquímica (IHC) O método utilizado para imunocoloração será o sistema amplificado com estreptavidina-biotina. Seções de tecido embebidas em parafina serão desparafinizadas em xileno, reidratadas em uma série graduada de etanol e incubadas com peróxido de hidrogênio a 3%. As lâminas serão enxaguadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, expostas à recuperação de epítopos induzida por calor em solução tampão citrato (Ph 6) por 20 minutos. Após resfriamento, as lâminas serão incubadas durante a noite em temperatura ambiente com anticorpo monoclonal de camundongo anti-CIRP (0,1 ml concentrado e diluído em PBS na diluição 1:75). A detecção da imunorreatividade será realizada utilizando o sistema Estreptavidina-Biotina Marcado Universal, peroxidase de rábano. Finalmente, a reação será visualizada por meio de um reagente substrato/cromógeno (diaminobenzidina) apropriado. O procedimento de coloração incluirá os controles negativos obtidos pela substituição de anticorpos primários por solução salina tamponada com fosfato (16).
3. Interpretação da imunocoloração CIRP:

A imunomarcação CIRP será avaliada separadamente e às cegas na lesão LP e nos casos controle. As células epidérmicas e dérmicas serão consideradas positivas pela presença de coloração acastanhada detectada pela reação DAB no citoplasma ou núcleos em ≥ 1 células coradas (25).