Evaluación de los niveles séricos y tisulares de proteína de unión a ARN inducible en frío en pacientes con liquen plano

Los objetivos de este estudio son:

• Evaluación de los niveles séricos y tisulares de CIRP en pacientes con LP.
• Comparar los niveles séricos y tisulares de CIRP en pacientes con LP y controles sanos.

• Comparar los niveles de CIRP según la gravedad de la LP. Se llevará a cabo un estudio transversal en 40 pacientes con LP y 40 controles sanos de la misma edad y sexo. El diagnóstico de LP será clínico y se confirmará mediante dermatoscopia.

  • Métodos del estudio:

    1. Evaluación de la expresión CIRP:

       Cada participante en este estudio será sometido a una toma de muestras de sangre y de una biopsia de piel en la misma sesión, luego cada muestra se procesará por separado y a ciegas en los Departamentos de Patología Clínica e Histología de la siguiente manera:

• Muestra de sangre:

Se tomarán tres ml de muestra de sangre venosa de cada uno de los dos grupos estudiados en un tubo de anticoagulante libre, permitiendo coagular la sangre. Después de 30 minutos de dejar el tubo a temperatura ambiente hasta la coagulación, las muestras se centrifugarán (a 3000 rpm durante 15 minutos) y el suero resultante se almacenará a -80 °C hasta el momento de la prueba (22). Los niveles séricos de CIRP se medirán utilizando un kit de análisis de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

• Biopsias de piel: Se tomará una biopsia de piel con punch de 3 mm de cada paciente y control. Estas biopsias se tomarán bajo anestesia local de las lesiones de LP y las mismas áreas se emparejarán en el control. Todas las biopsias se enviarán al Departamento de Histología de la Facultad de Medicina de Sohag. Se fijarán en formalina tamponada neutra al 10%, se deshidratarán en grados ascendentes de etanol seguido de inmersión en xileno y luego se impregnarán en parafina. Se tomarán varias secciones de 5 micras (5um) de espesor de cada bloque. Se teñirá un portaobjetos con hematoxilina y eosina (H&E) para un examen histopatológico de rutina. Otras secciones se montarán en portaobjetos cargados positivamente y se almacenarán a temperatura ambiente para teñirlas inmunohistoquímicamente.

1. Evaluación histopatológica de secciones teñidas con H&E:

   Las secciones teñidas con H&E se evaluarán bajo el microscopio óptico para confirmar el diagnóstico de LP y evaluar los cambios epidérmicos y dérmicos.

2. Procedimiento de tinción inmunohistoquímica (IHC) El método utilizado para la inmunotinción será el sistema amplificado con estreptavidina-biotina. Las secciones de tejido incluidas en parafina se desparafinarán en xileno, se rehidratarán en una serie graduada de etanol y se incubarán con peróxido de hidrógeno al 3%. Los portaobjetos se enjuagarán en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se expondrán a recuperación de epítopos inducida por calor en solución tampón de citrato (Ph 6) durante 20 minutos. Después de enfriar, los portaobjetos se incubarán durante la noche a temperatura ambiente con anticuerpo monoclonal de ratón anti-CIRP (0,1 ml concentrado y diluido con PBS en una dilución 1:75). La detección de inmunorreactividad se realizará mediante el sistema Universal Labeled Streptavidin-Biotin, peroxidasa de rábano picante. Finalmente, la reacción se visualizará mediante un reactivo sustrato/cromógeno (diaminobencidina) apropiado. El procedimiento de tinción incluirá los controles negativos obtenidos mediante sustitución de anticuerpos primarios con solución salina tamponada con fosfato (16).
3. Interpretación de la inmunotinción CIRP:

La inmunotinción CIRP se evaluará por separado y de forma ciega en casos de lesión de LP y de control. Las células epidérmicas y dérmicas se asignarán positivas por la presencia de coloración pardusca detectada mediante la reacción DAB ya sea en el citoplasma o en los núcleos en ≥ 1 célula teñida (25).