Hodnocení hladin chladem indukovatelného RNA-vazebného proteinu v séru a v tkáních u pacientů s lichen planus

Cíle této studie jsou:

• Stanovení sérových a tkáňových hladin CIRP u pacientů s LP.
• Porovnat sérové ​​a tkáňové hladiny CIRP u pacientů s LP a zdravých kontrol.

• Porovnat hladiny CIRP podle závažnosti LP. Průřezová studie bude provedena na 40 pacientech s LP a 40 zdravých kontrolách odpovídajících věku a pohlaví. Diagnóza LP bude klinicky a bude potvrzena dermoskopií.

  • Metody studia:

    1. Vyhodnocení exprese CIRP:

       Každý účastník této studie bude podroben odběru krve a odběru kožní biopsie ve stejném sezení, poté bude každý vzorek zpracován samostatně a naslepo na oddělení klinické patologie a histologie následovně:

• Odběr krve:

Z každé ze dvou studovaných skupin budou odebrány 3 ml vzorku žilní krve do volné antikoagulační zkumavky umožňující srážení krve. Po 30 minutách ponechání zkumavky při pokojové teplotě až do koagulace budou vzorky odstředěny (při 3000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut) a výsledné sérum bude skladováno při -80 °C až do testování (22). Hladiny CIRP v séru budou měřeny pomocí soupravy pro analýzu ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

• Kožní biopsie: Od každého pacienta a kontroly bude odebrána jedna kožní biopsie 3 mm děrováním. Tyto biopsie budou odebrány v lokální anestezii z LP lézí a stejných oblastí, které se shodují v kontrole. Všechny biopsie budou zaslány na histologické oddělení Lékařské fakulty Sohag. Budou fixovány v 10% neutrálním pufrovaném formalínu, dehydratovány ve vzestupných stupních etanolu, následně ponořeny do xylenu a poté impregnovány v parafínu. Z každého bloku bude odebráno několik 5 mikronů (5 um) silných řezů. Jedno sklíčko bude obarveno hematoxylinem a eosinem (H&E) pro rutinní histopatologické vyšetření. Další řezy budou upevněny na kladně nabitá sklíčka a skladovány při pokojové teplotě, aby byly imunohistochemicky obarveny.

1. Histopatologické hodnocení řezů obarvených H&E:

   Řezy obarvené H&E budou vyhodnoceny pod světelným mikroskopem, aby se potvrdila diagnóza LP a aby se vyhodnotily epidermální a dermální změny.

2. Postup imunohistochemického (IHC) barvení Metodou použitou pro imunobarvení bude systém amplifikovaný streptavidin-biotin. Tkáňové řezy zalité v parafínu budou deparafinizovány v xylenu, rehydratovány v odstupňované sérii ethanolu a inkubovány s 3% peroxidem vodíku. Sklíčka budou opláchnuta ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) a poté vystavena teplem indukovanému získávání epitopu v roztoku citrátového pufru (Ph 6) po dobu 20 minut. Po ochlazení budou sklíčka inkubována přes noc při teplotě místnosti s myší monoklonální anti-CIRP protilátkou (0,1 ml koncentrované a zředěné PBS v ředění 1:75). Detekce imunoreaktivity bude provedena pomocí systému Universal Labeled Streptavidin-Biotin, křenová peroxidáza. Nakonec bude reakce vizualizována vhodným činidlem substrát/chromogen (diaminobenzidin). Postup barvení bude zahrnovat negativní kontroly získané substitucí primárních protilátek fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (16).
3. Interpretace imunobarvení CIRP:

Imunologické barvení CIRP bude hodnoceno samostatně a slepě u lézí LP a kontrolních případů. Epidermální a dermální buňky budou označeny jako pozitivní na základě přítomnosti nahnědlého zbarvení detekovaného reakcí DAB buď v cytoplazmě nebo v jádrech u ≥ 1 obarvené buňky (25).