Оценка уровня холодоиндуцируемого РНК-связывающего белка в сыворотке и тканях у пациентов с плоским лишаем

Цели данного исследования:

• Оценка уровня CIRP в сыворотке и тканях у пациентов с КПЛ.
• Сравнить уровни CIRP в сыворотке и тканях у пациентов с ЛП и здоровых людей.

• Сравнить уровни CIRP в зависимости от тяжести ЛП. Поперечное исследование будет проведено на 40 пациентах с ЛП и 40 здоровых людях контрольной группы, соответствующих возрасту и полу. Диагноз ЛП ставится клинически и подтверждается дерматоскопией.

  • Методы исследования:

    1. Оценка экспрессии CIRP:

       У каждого участника этого исследования будут взяты как пробы крови, так и биопсия кожи за один и тот же сеанс, затем каждый образец будет обработан отдельно и вслепую в отделениях клинической патологии и гистологии следующим образом:

• Забор крови:

У каждой из двух исследуемых групп будет взят образец венозной крови по три мл в свободную пробирку с антикоагулянтом, что позволит крови свернуться. После 30 минут пребывания пробирки при комнатной температуре до коагуляции образцы центрифугируются (при 3000 об/мин в течение 15 минут), а полученная сыворотка хранится при температуре -80°С до проведения тестирования (22). Уровни CIRP в сыворотке будут измеряться с использованием набора для иммуноферментного анализа (ELISA).

• Биопсия кожи: у каждого пациента и контрольной группы с помощью пункции 3 мм будет взята одна биопсия кожи. Эти биопсии будут взяты под местной анестезией из поражений LP и тех же областей, что и в контрольной группе. Все биопсии будут отправлены в отделение гистологии медицинского факультета Сохага. Их фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине, обезвоживают в этаноле возрастающей степени с последующим погружением в ксилол и затем пропитывают парафином. Из каждого блока будет взято несколько срезов толщиной 5 микрон (5 мкм). Одно предметное стекло будет окрашено гематоксилином и эозином (H&E) для обычного гистопатологического исследования. Другие срезы будут помещены на положительно заряженные предметные стекла и сохранены при комнатной температуре для иммуногистохимического окрашивания.

1. Гистопатологическая оценка срезов, окрашенных H&E:

   Срезы, окрашенные H&E, будут оцениваться под световым микроскопом для подтверждения диагноза ЛП и оценки эпидермальных и дермальных изменений.

2. Процедура иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания. Для иммуноокрашивания используется метод, амплифицированный стрептавидин-биотин. Срезы тканей, залитые в парафин, депарафинизируют в ксилоле, регидратируют в этаноле ступенчатой ​​концентрации и инкубируют с 3%-ным раствором перекиси водорода. Слайды промывают в фосфатно-солевом буфере (PBS), а затем подвергают индуцированному нагреванием извлечению эпитопа в цитратном буферном растворе (Ph 6) в течение 20 минут. После охлаждения предметные стекла инкубируют в течение ночи при комнатной температуре с мышиными моноклональными антителами против CIRP (0,1 мл концентрируют и разводят PBS в разведении 1:75). Выявление иммунореактивности будет проводиться с использованием универсальной меченой системы стрептавидин-биотин, пероксидазы хрена. Наконец, реакция будет визуализирована с помощью соответствующего реагента субстрат/хромоген (диаминобензидин). Процедура окрашивания будет включать отрицательные контроли, полученные путем замены первичных антител фосфатно-солевым буфером (16).
3. Интерпретация иммуноокрашивания CIRP:

Иммуноокрашивание CIRP будет оцениваться отдельно и вслепую в случаях поражения LP и в контрольных случаях. Эпидермальные и дермальные клетки будут считаться положительными по наличию коричневатой окраски, обнаруженной с помощью реакции DAB либо в цитоплазме, либо в ядрах в ≥ 1 окрашенных клетках (25).