Jama zatokowo-nosowa jako rezerwuar rozwoju bakterii górnych dróg oddechowych

Badanie dynamiki społeczności drobnoustrojów ma kluczowe znaczenie dla zdrowia ludzi, w tym sposobów utrzymania lub przywrócenia zdrowego mikrobiomu. Badania metagenomiczne zrewolucjonizowały mikrobiologię, zajmując się tymi kwestiami w sposób niezależny od kultury i zdefiniowały podstawowe role mikrobiomu w rozwoju żywiciela. Początkowy rozwój mikroflory jelitowej rozpoczyna się w macicy i jest pod silnym wpływem narażenia przy urodzeniu (np. poród siłami natury vs cesarskie cięcie). Uważa się, że początkowe wysiewanie przez mikroflorę matki i następującą po nim sukcesję bakteryjną ma krytyczny długoterminowy wpływ na zdrowie człowieka. Niedawne badania podłużne udokumentowały stopniowy wzrost różnorodności bakterii, nieprzypadkowe gromadzenie się społeczności, wpływ mleka matki i wprowadzanie pokarmów stołowych oraz duże zmiany taksonomiczne w wyniku antybiotyków i stresów środowiskowych, które występują w okresie niemowlęcym. Ponieważ zaburzenia tych wczesnych zdarzeń zostały powiązane z cukrzycą, rakiem, zdrowiem psychicznym i szeregiem innych chorób, trwają wysiłki, aby dowiedzieć się, w jaki sposób manipulacja mikrobiomem niemowlęcia do „zdrowego” stanu przekłada się na długoterminowe wyniki kliniczne.

Natomiast niewiele uwagi poświęcono czynnikom, które regulują rozwój mikroflory dróg oddechowych we wczesnym okresie życia, w tym jamy ustnej. Po urodzeniu flora jamy ustnej i nosogardzieli jest podobna do flory pochwy lub skóry matki (w zależności od sposobu porodu). Wstępne zestawy danych sugerują, że w pierwszym roku życia mikrobiom dróg oddechowych ewoluuje w bogaty, podobny do dorosłego ekosystem mikrobiologiczny. Uważa się, że kluczowi kolonizatorzy dróg oddechowych warunkują późniejszą kolonizację przez ponad 600 gatunków, z których niektóre służą do tworzenia silnych społeczności bakteryjnych charakterystycznych dla zdrowia ludzkiego. Inni wtórni kolonizatorzy są często zaangażowani w infekcje jamy ustnej i dróg oddechowych, w tym przewlekłe zapalenie zatok, zapalenie płuc i choroby przyzębia. Na przykład kolonizacja niemowląt przez Streptococcus pneumoniae jest ważnym czynnikiem ryzyka choroby ucha środkowego u dzieci. Wczesne społeczności drobnoustrojów stanowią zatem główne czynniki, które regulują kolonizację dróg oddechowych zarówno przez drobnoustroje chorobotwórcze, jak i ochronne podczas rozwoju mikrobiomu niemowląt. Zrozumienie pozyskiwania zbiorowisk mikrobiologicznych dróg oddechowych niemowląt i czynników, które zmieniają ich skład, ma kluczowe znaczenie dla promocji zdrowia ludzkiego i zapobiegania chorobom dróg oddechowych, które stanowią roczne wielomiliardowe obciążenie dla amerykańskiego systemu opieki zdrowotnej.

Podczas gdy wymiana mikroflory dróg oddechowych między matką a noworodkiem jest dobrze udokumentowana, żadne badania nie badały zależności wewnątrzobiektowych między jamą ustną, zatokami, nosogardłem i płucami oraz względnej liczebności taksonów bakteryjnych w tych miejscach. Ostatnie dowody sugerują, że jama ustna może służyć jako rezerwuar patogenów, które przemieszczają się do miejsc innych niż usta; Drobnoustroje związane z jamą ustną infekują większość innych miejsc ciała, czego dowodem jest sekwencjonowanie 16S. Jednak dwa zastrzeżenia sprawiają, że ten przerzut bakteryjny jest kontrowersyjny. Po pierwsze, fakt, że bakterie jamy ustnej nie znajdują się wyłącznie w jamie ustnej, ale także w innych częściach dróg oddechowych, utrudnia ustalenie ich pochodzenia. Zatem kierunkowość wymiany mikrobiologicznej między przestrzeniami niszy dróg oddechowych nie jest znana. Po drugie, większość badań rybosomalnego RNA (rRNA) 16S ujawnia jedynie skład bakterii na poziomie rodzaju lub typu, dostarczając niewiele informacji na temat rodowodów szczepów i tego, czy poszczególne szczepy mogą migrować między miejscami. Dane te mają kluczowe znaczenie dla promowania rozwoju ochronnej mikroflory przy jednoczesnym ograniczeniu wzrostu opornych patogenów.

Pełniejsze zrozumienie tego handlu zaczyna się od dogłębnych badań na poziomie szczepu społeczności bakteryjnych obecnych w każdej niszy dróg oddechowych wkrótce po urodzeniu i ich rozwoju w czasie. Jako krok w tym kierunku, to sponsorowane przez Akademickie Centrum Zdrowia badanie wykorzysta sekwencjonowanie metagenomiczne do oceny wymiany określonych szczepów bakteryjnych w górnych drogach oddechowych. Nasze badania na myszach (wyjaśnione w innym miejscu) zostaną uzupełnione badaniem niemowląt z mukowiscydozą (CF), które reprezentują wyjątkową populację, która ułatwia wychwytywanie mikroflory jamy ustnej, zatok przynosowych i płuc w ciągu pierwszych dwóch lat życia. Wykorzystując kombinację wymazów z jamy ustnej i gardła, wraz z odsysaniem próbek śluzu przez nos, do scharakteryzowania składu zbiorowisk bakteryjnych w każdym miejscu anatomicznym zostanie zastosowane podejście sekwencjonowania metagenomicznego. Począwszy od urodzenia, badacze będą zbierać serie wymazów od każdej osoby i monitorować zmiany w rozwoju mikroflory w czasie. W ten sposób nasze badania oświetlą ruch w drogach oddechowych zarówno pożytecznych, jak i patogennych drobnoustrojów i mogą stanowić istotny patofizjologiczny krok w kierunku przesunięcia równowagi między zdrowiem dróg oddechowych a chorobą.

PLAN DOŚWIADCZENIA Rozwój zbiorowisk bakteryjnych dróg oddechowych będzie monitorowany w małej kohorcie pacjentów z mukowiscydozą. Ponieważ niemowlęta z mukowiscydozą są monitorowane od urodzenia i rutynowo pobiera się od nich próbki mikroflory dróg oddechowych podczas rutynowych wizyt ambulatoryjnych w ramach standardowej opieki, stanowią one wyjątkową populację do monitorowania przemieszczania się bakterii między jamą ustną, nosową i płucną. Wszystkie noworodki na University of Minnesota (UMN) są badane genetycznie. Osoby z dodatnim wynikiem testu na mukowiscydozę zostaną potwierdzone za pomocą testu potowego pilokarpiny. Od pacjentów z pozytywnym wynikiem (z 2 mutacjami mutacji regulatora przewodnictwa przezbłonowego mukowiscydozy [CFTR]) zostaną następnie pobrane próbki podczas wizyt uczestników w ośrodku leczenia mukowiscydozy; średnio niemowlęta będą przyjmowane co miesiąc przez pierwsze 6 miesięcy, co drugi miesiąc do 1 roku życia, następnie co kwartał wizyty w Centrum CF UMN (zgodnie z wytycznymi Fundacji Mukowiscydozy). W ramach standardu opieki podczas każdej wizyty pobierane są wycinki z nosa przez odsysanie. Nylonowe waciki zostaną również użyte do pobrania próbki błony śluzowej policzka każdego niemowlęcia. Uzyskane zostaną również wymazy z jamy ustnej i gardła, które uważa się za dokładne odwzorowanie mikrobiomów dolnych dróg oddechowych (płuc). Na podstawie przewidywanej liczby noworodków z mukowiscydozą w okresie badania badacze planują rekrutację do 10 pacjentów. Od każdego niemowlęcia zostanie pobranych do 10 wymazów skroniowych z każdego miejsca dróg oddechowych (10 niemowląt x 10 wymazów x 3 miejsca = 300 próbek). Wymazy będą przechowywane w soli fizjologicznej, zamrożone w temperaturze -80°C i przetwarzane równolegle.

DNA zostanie wyekstrahowane z każdej próbki wymazu, a sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone w University of Minnesota Genomics Center.