Zakażenia wirusowe w BAL i biopsjach oskrzeli stabilnych pacjentów z POChP

Pacjenci i grupa kontrolna Populację badania stanowili kolejni chorzy ze stabilną POChP oraz grupa kontrolna, którzy zostali skierowani do badaczy w okresie od października 2012 do listopada 2014 roku w celu wykonania bronchoskopii światłowodowej w celach diagnostycznych (np. rak płuca) lub terapeutycznych (m.in. , krwioplucie). W czasie badania stan kliniczny i funkcjonalny pacjentów z POChP był stabilny przez co najmniej 4 tygodnie, a żaden z nich nie był leczony antybiotykami w ciągu ostatnich 4 tygodni. Kryteria wykluczenia obejmowały wywiad atopowy, astmę, rozległe wysięki opłucnowe, rozstrzenie oskrzeli, immunosupresję spowodowaną chemioterapią lub ogólnoustrojowymi kortykosteroidami oraz wszystkie przeciwwskazania do zabiegów bronchoskopowych. Ciężkość POChP sklasyfikowano na podstawie wartości spirometrycznych po podaniu leku rozszerzającego oskrzela, zgodnie z wytycznymi Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD). Pacjenci byli również oceniani według połączonej oceny POChP. W tej klasyfikacji wpływ choroby na indywidualnego pacjenta określa się na podstawie oceny objawów (wyniki CAT lub mMRC), klasyfikacji spirometrycznej pacjenta i/lub ryzyka zaostrzeń (liczba zaostrzeń i historia hospitalizacji z powodu zaostrzenia w poprzednim roku). Grupę kontrolną stanowiły osoby niepalące lub obecne/byłe palacze bez POChP. Stan byłego palacza zdefiniowano jako zaprzestanie palenia co najmniej 1 rok wcześniej.

Wszyscy uczestnicy wypełnili ankietę zawierającą cechy demograficzne oraz status palenia papierosów (paczka/rok). Stan kliniczny oceniano według zmodyfikowanej skali duszności Medical Research Council (mMRC) oraz wskaźnika BODE (masa ciała, przeszkoda w przepływie powietrza, duszność, wysiłek fizyczny). Przeprowadzono badanie funkcji płuc oraz zmierzono gazometrię krwi tętniczej i wysycenie krwi tlenem za pomocą pulsoksymetrii w pozycji siedzącej. Pacjentów pytano o liczbę i charakterystykę poprzedzających zaostrzeń, liczbę i czas trwania poprzedzających hospitalizacji z powodu chorób układu oddechowego, przebyty wywiad (astma, alergia, zapalenie zatok czy polipy nosa), obecność chorób współistniejących (choroby serca, nowotwory, itp.) oraz wszystkie stosowane przez nich leki.

Zarówno chorzy na POChP, jak i osoby kontrolne zostały odpowiednio przygotowane (znieczulenie miejscowe i sedacja dożylna) do wykonania przeznosowej bronchoskopii światłowodowej. Po rutynowej kontroli bronchoskopowej drzewa tchawiczo-oskrzelowego badacze wykonali BAL z oskrzeli subsegmentalnych i biopsje oskrzeli (3-4 na pacjenta) z ostrogi nienacieczonej.

Wszystkie próbki podzielono na porcje, zamrożono i przechowywano w ciągu 1 godziny po pobraniu. Próbki RNA do wykrywania HRV i RSV ekstrahowano z biopsji BAL i płuc, stosując całkowity kwas nukleinowy wirusa Maxwell 16 (Promega). Częściową sekwencję genu nukleokapsydu (N), jak również częściową sekwencję regionu niekodującego 5΄ (5΄NCR) zamplifikowano odpowiednio dla RSV i HRV.

Przeprowadzono badania PCR w czasie rzeczywistym. Zastosowana mieszanka starterów/sond wykazuje szeroką homologię z szerokim zakresem serotypów HRV. Ponadto startery/sondy dla RSV są w stanie rozróżnić podtypy RSV A i B, jednocześnie wykluczając blisko spokrewnione ludzkie metapneumowirusy. Dostarczona mieszanka starterów i sond wykorzystywała tak zwaną zasadę TaqMan. Sonda fluorogeniczna została włączona do tej samej mieszaniny reakcyjnej, która składała się z sondy DNA znakowanej barwnikiem 5' i wygaszaczem 3'. Poza tym sondę przecięto i oddzielono barwnik reporterowy i wygaszacz. Wynikający z tego wzrost fluorescencji można wykryć na wielu platformach PCR w czasie rzeczywistym. Za każdym razem, gdy używano zestawów, w analizie uwzględniono pozytywną i negatywną reakcję kontrolną.