Infezioni virali in BAL e biopsie bronchiali di pazienti con BPCO stabile

Pazienti e soggetti di controllo La popolazione dello studio era composta da pazienti consecutivi con BPCO stabile e soggetti di controllo, che sono stati indirizzati agli sperimentatori tra ottobre 2012 e novembre 2014 per essere sottoposti a broncoscopia a fibre ottiche per scopi diagnostici (ad es. cancro ai polmoni) o terapeutici (ad es. , emottisi). Al momento dello studio, lo stato clinico e funzionale dei pazienti con BPCO era stabile da almeno 4 settimane e nessuno aveva ricevuto un trattamento antibiotico nelle ultime 4 settimane. I criteri di esclusione includevano anamnesi atopica, asma, estesi versamenti pleurici, bronchiectasie, immunosoppressione dovuta a chemioterapia o corticosteroidi sistemici e tutte le controindicazioni delle procedure broncoscopiche. La gravità della BPCO è stata classificata utilizzando i valori spirometrici postbroncodilatatori secondo le linee guida della Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD). Inoltre, i pazienti sono stati valutati secondo la valutazione combinata della BPCO. In questa classificazione l'impatto della malattia su un singolo paziente è determinato dalla combinazione della valutazione sintomatica (punteggi CAT o mMRC), della classificazione spirometrica del paziente e/o del rischio di riacutizzazioni (numero di riacutizzazioni e anamnesi di ospedalizzazione dovuta a riacutizzazioni nell'anno precedente). Il gruppo di controllo era costituito da non fumatori o attuali/ex fumatori senza BPCO. La condizione di ex-fumatore è stata definita come la cessazione dell'abitudine al fumo almeno 1 anno prima.

Tutti i partecipanti hanno completato un questionario che includeva le caratteristiche demografiche e lo stato di fumo di sigaretta (pacchetto/anno). Lo stato clinico è stato valutato in base alla scala di dispnea modificata del Medical Research Council (mMRC) e all'indice di massa corporea, ostruzione del flusso d'aria, dispnea, esercizio (BODE). È stato eseguito il test di funzionalità polmonare e sono stati misurati i gas del sangue arterioso e la saturazione di ossigeno nel sangue mediante pulsossimetria in posizione seduta. Ai pazienti è stato chiesto il numero e le caratteristiche delle precedenti riacutizzazioni, il numero e la durata dei precedenti ricoveri per disturbi respiratori, la loro storia medica pregressa (asma, allergia, sinusite o polipi nasali), la presenza di comorbilità (cardiopatie, neoplasie, e.t.c.), e tutti i farmaci che hanno usato.

Sia i pazienti con BPCO che i soggetti di controllo sono stati opportunamente preparati (anestesia locale e sedazione endovenosa) per essere sottoposti a fibrobroncoscopia transnasale. Dopo l'ispezione broncoscopica di routine dell'albero tracheobronchiale, i ricercatori hanno eseguito BAL da bronchi subsegmentali e biopsie bronchiali (3-4 per paziente) da carena non infiltrata.

Tutti i campioni sono stati aliquotati, congelati e conservati entro 1 ora dal prelievo. I campioni di RNA per il rilevamento di HRV e RSV sono stati estratti da BAL e biopsie polmonari utilizzando l'acido nucleico totale virale Maxwell 16 (Promega). Una sequenza parziale del gene Nucleocapsid (N), nonché una sequenza parziale della regione non codificante 5΄ (5΄NCR) sono state amplificate rispettivamente per RSV e HRV.

Sono stati eseguiti studi PCR in tempo reale. La miscela di primer/sonde utilizzata presenta un'ampia omologia con un'ampia gamma di sierotipi di HRV. Inoltre, i primer/sonde per RSV sono in grado di distinguere i sottotipi A e B di RSV escludendo i metapneumovirus umani strettamente correlati. La miscela di primer e sonda fornita sfruttava il cosiddetto principio TaqMan. Una sonda fluorogenica è stata inclusa nella stessa miscela di reazione che consisteva in una sonda di DNA marcata con un colorante 5' e un quencher 3'. Inoltre, la sonda è stata scissa e il colorante reporter e il quencher sono stati separati. Il conseguente aumento della fluorescenza potrebbe essere rilevato su una gamma di piattaforme PCR in tempo reale. Ogni volta che i kit sono stati utilizzati, nella serie sono state incluse una reazione di controllo positiva e una negativa.