Вирусные инфекции в биоптатах БАЛ и бронхов у пациентов со стабильной ХОБЛ

Пациенты и контрольные субъекты Популяция исследования состояла из последовательных пациентов со стабильной ХОБЛ и контрольных субъектов, которые были направлены исследователям в период с октября 2012 г. по ноябрь 2014 г. для прохождения фибробронхоскопии для диагностики (например, рак легкого) или лечения (например, рак легких). , кровохарканье) целей. На момент исследования клиническое и функциональное состояние пациентов с ХОБЛ было стабильным в течение как минимум 4 недель, и ни один из них не получал антибиотикотерапию в течение последних 4 недель. Критерии исключения включали атопический анамнез, астму, обширные плевральные выпоты, бронхоэктазы, иммуносупрессию вследствие химиотерапии или системных кортикостероидов и все противопоказания к бронхоскопическим процедурам. Тяжесть ХОБЛ классифицировали с использованием спирометрических значений после бронходилататора в соответствии с рекомендациями Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких (GOLD). Также пациентов оценивали по комбинированной оценке ХОБЛ. В этой классификации влияние заболевания на отдельного пациента определяется комбинацией симптоматической оценки (шкалы CAT или mMRC), спирометрической классификации пациента и/или риска обострений (количество обострений и история госпитализаций в связи с обострением). в предыдущем году). Контрольную группу составили некурящие или нынешние/бывшие курильщики без ХОБЛ. Бывшее курение определялось как прекращение курения как минимум за 1 год до этого.

Все участники заполнили анкету, которая включала демографические характеристики и статус курения сигарет (пачка/год). Клинический статус оценивали по модифицированной шкале Медицинского исследовательского совета (mMRC) одышки и индексу массы тела, обструкции дыхательных путей, одышке, физической нагрузке (BODE). Было выполнено исследование функции легких и измерены газы артериальной крови и насыщение крови кислородом с помощью пульсоксиметрии в положении сидя. Пациентов опрашивали о количестве и характеристике предшествующих обострений, числе и продолжительности предшествующих госпитализаций по поводу респираторных заболеваний, перенесенном анамнезе (астма, аллергия, синусит или полипы носа), наличии сопутствующих заболеваний (пороки сердца, злокачественные новообразования, и т.д.), и все лекарства, которые они использовали.

Как пациенты с ХОБЛ, так и контрольные субъекты были соответствующим образом подготовлены (местная анестезия и внутривенная седация) для проведения трансназальной фиброоптической бронхоскопии. После рутинного бронхоскопического осмотра трахеобронхиального дерева исследователи выполнили БАЛ из субсегментарных бронхов и биопсии бронхов (3-4 на пациента) из неинфильтрированного киля.

Все образцы делили на аликвоты, замораживали и хранили в течение 1 часа после отбора. Образцы РНК для обнаружения HRV и RSV экстрагировали из БАЛ и биоптатов легких с использованием тотальной нуклеиновой кислоты вируса Maxwell 16 (Promega). Частичную последовательность гена нуклеокапсида (N), а также частичную последовательность 5΄ некодирующей области (5΄NCR) амплифицировали для RSV и HRV соответственно.

Были проведены ПЦР-исследования в реальном времени. Используемая смесь праймеров/зондов имеет широкую гомологию с большим диапазоном серотипов HRV. Кроме того, праймеры/зонды для RSV способны различать подтипы RSV A и B, исключая близкородственные метапневмовирусы человека. В смеси праймеров и зондов использовался так называемый принцип TaqMan. В ту же реакционную смесь, состоящую из ДНК-зонда, меченного 5'-красителем, и 3'-тушителя, был включен флуорогенный зонд. Кроме того, зонд расщепляли и разделяли репортерный краситель и гаситель. В результате увеличение флуоресценции может быть обнаружено на ряде платформ ПЦР в реальном времени. Каждый раз при использовании наборов в цикл включали положительный и отрицательный контрольные реакции.