Infecções virais em BAL e biópsias brônquicas de pacientes com DPOC estável

Pacientes e indivíduos de controle A população do estudo consistiu de pacientes consecutivos com DPOC estável e indivíduos de controle, que foram encaminhados aos investigadores entre outubro de 2012 e novembro de 2014 para serem submetidos à broncoscopia de fibra óptica para diagnóstico (por exemplo, câncer de pulmão) ou terapêutico (por exemplo, , hemoptise). Na época do estudo, o estado clínico e funcional dos pacientes com DPOC estava estável por pelo menos 4 semanas, e nenhum havia recebido tratamento antibiótico nas últimas 4 semanas. Os critérios de exclusão incluíram antecedentes atópicos, asma, derrames pleurais extensos, bronquiectasias, imunossupressão por quimioterapia ou corticosteróides sistémicos e todas as contra-indicações dos procedimentos broncoscópicos. A gravidade da DPOC foi classificada usando valores espirométricos pós-broncodilatadores de acordo com as diretrizes da Iniciativa Global para Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (GOLD). Além disso, os pacientes foram avaliados de acordo com a avaliação combinada de DPOC. Nesta classificação, o impacto da doença em um paciente individual é determinado a partir da combinação da avaliação sintomática (escores CAT ou mMRC), classificação espirométrica do paciente e/ou risco de exacerbações (número de exacerbações e história de hospitalização devido a exacerbação no ano anterior). O grupo controle era composto por não fumantes ou fumantes atuais/ex-fumantes sem DPOC. A condição de ex-fumante foi definida como a cessação do hábito de fumar há pelo menos 1 ano.

Todos os participantes preencheram um questionário que incluía características demográficas e tabagismo (maço/ano). O estado clínico foi avaliado de acordo com a escala modificada do Medical Research Council (mMRC) de falta de ar e o índice Body mass, airflow Obstruction, Dyspnea, Exercise (BODE). Prova de função pulmonar foi realizada e gasometria arterial e saturação de oxigênio no sangue por oximetria de pulso na posição sentada foram medidos. Os pacientes foram questionados sobre o número e as características das exacerbações anteriores, o número e a duração das hospitalizações anteriores por distúrbios respiratórios, sua história médica pregressa (asma, alergia, sinusite ou pólipos nasais), a presença de comorbidades (doenças cardíacas, malignidades, e.t.c.), e toda a medicação que utilizavam.

Tanto os pacientes com DPOC quanto os controles foram devidamente preparados (anestesia local e sedação endovenosa) para a realização da broncoscopia transnasal com fibra óptica. Após a inspeção broncoscópica de rotina da árvore traqueobrônquica, os investigadores realizaram BAL de brônquios subsegmentares e biópsias brônquicas (3-4 por paciente) de carina não infiltrada.

Todas as amostras foram aliquotadas, congeladas e armazenadas dentro de 1 hora após a amostragem. As amostras de RNA de detecção de HRV e RSV foram extraídas de BAL e biópsias pulmonares usando o ácido nucleico total viral Maxwell 16 (Promega). Uma sequência parcial do gene nucleocapsídeo (N), bem como uma sequência parcial da região não codificante 5΄ (5΄NCR) foram amplificadas para RSV e HRV, respectivamente.

Estudos de PCR em tempo real foram realizados. A mistura de primers/sondas, que foram utilizados, tem ampla homologia com uma grande variedade de sorotipos de HRV. Além disso, os primers/sondas para RSV são capazes de distinguir os subtipos A e B de RSV, ao mesmo tempo em que excluem os metapneumovírus humanos estreitamente relacionados. A mistura de primer e sonda fornecida explorou o chamado princípio TaqMan. Uma sonda fluorogênica foi incluída na mesma mistura de reação que consistia em uma sonda de DNA marcada com um corante 5' e um extintor 3'. Além disso, a sonda foi clivada e o corante repórter e o quencher foram separados. O aumento resultante na fluorescência pode ser detectado em uma variedade de plataformas de PCR em tempo real. Cada vez que os kits foram usados, uma reação de controle positiva e negativa foi incluída na corrida.