Profilowanie proteomiczne wrodzonej przepukliny przeponowej (pro-CDH)

Pacjentki w ciąży, u których zostanie wykonana amniopunkcja w ramach postępowania prenatalnego z CDH potwierdzoną USG płodu, będą kierowane do badania. Wskazania do amniopunkcji będą wskazane zgodnie ze zwykłymi standardami opieki. Krótko mówiąc, badanie nie będzie obejmować żadnej dodatkowej procedury inwazyjnej. W naszym badaniu amniopunkcja będzie wskazana podczas konwencjonalnego postępowania u tych pacjentek. Potrzeby naszych badań nie będą prowadzić do dodatkowych amniopunkcji, a po prostu do zwiększenia objętości pobieranego płynu owodniowego. W przypadku objętości zwykle pobieranych od 20 do 30 ml zostanie pobrana dodatkowa objętość 5 ml. Taka ilość próbek będzie miała bardzo ograniczony wpływ na dobrostan matki i płodu. Przeprowadzona zostanie analiza białka płynu owodniowego pacjentek. Względne ilości białek i peptydów zawartych w płynie owodniowym zostaną przeanalizowane w celu zbadania zmian w profilu proteomicznym, które mogą odzwierciedlać różną wagę kliniczną pod względem dalszej ewolucji. Procedury związane z badaniami nie zmienią zwykłego postępowania z pacjentami i ich dziećmi.

Pierwszym krokiem będzie przeprowadzenie deplecji głównych białek, w szczególności albuminy. Test białka zostanie przeprowadzony z tej samej ilości białka dla każdej próbki (standaryzacja). Po tym etapie wyczerpywania nastąpi etap migracji na żelu do elektroforezy 1D. Jego celem jest zarówno wyeliminowanie wszystkich zanieczyszczeń, które mogą utrudniać analizę spektrometrii mas, rozdzielenie białek według ich masy cząsteczkowej w celu uproszczenia mieszaniny białek oraz wizualna kontrola niejednorodności próbki. Różnicowa analiza wizualna po barwieniu pozwoli określić wysoce zmienne strefy pomiędzy grupami pacjentów oraz w obrębie tej samej próbki. Strefę zainteresowania wybierzemy w identyczny sposób dla każdej próbki i dla całej ścieżki żelowej. Stosowanie komercyjnych żeli do elektroforezy z tej samej serii i równoległa analiza kilku próbek z różnych grup oraz stosowanie kontroli jakości zapewniają powtarzalność. Białka zawarte w tych prążkach/strefach żelowych są następnie trawione zgodnie ze znormalizowanym protokołem w kontrolowanych warunkach. Jednoczesna obróbka różnych próbek biologicznych umożliwia znaczne zmniejszenie wpływu zmienności tego etapu na końcową różnicową analizę statystyczną. Pod koniec tego etapu białka analizuje się metodą LC-ESI MS/MS. To podejście LC-ESI MS/MS polega na rozdzielaniu peptydów na chromatograficznej kolumnie rozdzielającej, która jest połączona bezpośrednio ze spektrometrem masowym ESI-MS/M. To podejście analityczne może pozwolić na identyfikację ponad 1000 białek i 5000 peptydów. Analizę tę powtarza się 3 razy na próbkę, aby można było uwzględnić zmienność analityczną w różnicowych badaniach statystycznych. Na koniec tego protokołu surowe dane z każdej strefy są łączone dla próbki i można przeprowadzić różnicowe badanie statystyczne.