Perfil Proteômico para Hérnia Diafragmática Congênita (pro-CDH)

Pacientes grávidas para as quais a amniocentese será realizada como parte do manejo pré-natal de HDC confirmada por ultrassonografia fetal serão abordadas para inclusão no estudo. A indicação da amniocentese será indicada de acordo com os padrões usuais de atendimento. Resumidamente, o estudo não envolverá nenhum procedimento invasivo adicional. Em nosso estudo, a amniocentese será indicada durante o manejo convencional desses pacientes. As necessidades de nossa pesquisa não levarão a amniocenteses adicionais, mas simplesmente a um aumento no volume de líquido amniótico coletado. Um volume adicional de 5 ml será amostrado para volumes normalmente retirados de 20 a 30 ml. Este volume de amostragem terá um impacto muito limitado no bem-estar materno e fetal. Será realizada uma análise da proteoma do líquido amniótico dos pacientes. As quantidades relativas de proteínas e peptídeos contidos no líquido amniótico serão analisadas para explorar variações no perfil proteômico que podem refletir diferentes gravidades clínicas em termos de evolução posterior. O manejo usual dos pacientes e seus filhos não será modificado pelos procedimentos relacionados à pesquisa.

A primeira etapa consistirá em realizar uma depleção das principais proteínas, em particular a albumina. Será realizado um ensaio de proteína a partir da mesma quantidade de proteína para cada amostra (padronização). Esta etapa de depleção será seguida por uma etapa de migração em um gel de eletroforese 1D. Sua finalidade é eliminar todos os contaminantes que podem atrapalhar a análise por espectrometria de massas, separar as proteínas de acordo com seu peso molecular para simplificar a mistura de proteínas e ter um controle visual da heterogeneidade da amostra. Uma análise visual diferencial após a coloração permitirá definir as zonas altamente variáveis ​​entre os grupos de pacientes e dentro da mesma amostra. Selecionaremos a zona de interesse de maneira idêntica para cada amostra e para toda a faixa de gel. A utilização de géis de eletroforese comerciais do mesmo lote e a análise paralela de várias amostras de diferentes grupos e o uso de controles de qualidade garantem a reprodutibilidade. As proteínas contidas nessas bandas/zonas de gel são então digeridas de acordo com um protocolo padronizado em condições controladas. O tratamento simultâneo das diferentes amostras biológicas permite reduzir consideravelmente o impacto da variabilidade desta etapa na análise estatística diferencial final. No final desta etapa, as proteínas são analisadas por uma abordagem LC-ESI MS/MS. Esta abordagem LC-ESI MS/MS consiste na separação dos peptídeos em uma coluna de separação cromatográfica que é acoplada diretamente ao espectrômetro de massa ESI-MS/M. Esta abordagem analítica pode permitir a identificação de mais de 1.000 proteínas e 5.000 peptídeos. Esta análise é repetida 3 vezes por amostra para que a variabilidade analítica possa ser levada em consideração em estudos estatísticos diferenciais. No final deste protocolo, os dados brutos de cada zona são agrupados por amostra e o estudo estatístico diferencial pode ser realizado.