Perfiles proteómicos para la hernia diafragmática congénita (pro-CDH)

Se abordará la inclusión en el estudio de pacientes embarazadas a quienes se les realizará una amniocentesis como parte del manejo prenatal de HDC confirmada por ecografía fetal. La indicación de amniocentesis se indicará según las normas asistenciales habituales. Brevemente, el estudio no implicará ningún procedimiento invasivo adicional. En nuestro estudio, la amniocentesis estará indicada durante el manejo convencional de estos pacientes. Las necesidades de nuestra investigación no conducirán a amniocentesis adicionales, sino simplemente a un aumento en el volumen de líquido amniótico recolectado. Se tomará una muestra de un volumen adicional de 5 ml para volúmenes normalmente tomados de 20 a 30 ml. Este volumen de muestreo tendrá un impacto muy limitado en el bienestar materno y fetal. Se realizará un análisis de la proteoma del líquido amniótico de los pacientes. Se analizarán las cantidades relativas de proteínas y péptidos contenidos en el líquido amniótico para explorar variaciones en el perfil proteómico que pueden reflejar diferente gravedad clínica en términos de evolución posterior. El manejo habitual de los pacientes y sus hijos no se verá modificado por los procedimientos relacionados con la investigación.

El primer paso consistirá en realizar una depleción de las proteínas mayoritarias, en particular de la albúmina. Se realizará un ensayo de proteínas a partir de la misma cantidad de proteína para cada muestra (estandarización). A este paso de agotamiento le seguirá un paso de migración en un gel de electroforesis 1D. Su finalidad es tanto eliminar todos los contaminantes que puedan dificultar el análisis por espectrometría de masas, como separar las proteínas según su peso molecular para simplificar la mezcla de proteínas y tener un control visual de la heterogeneidad de la muestra. Un análisis visual diferencial tras la tinción permitirá definir las zonas altamente variables entre los grupos de pacientes y dentro de una misma muestra. Seleccionaremos la zona de interés de forma idéntica para cada muestra y para todo el track de gel. El uso de geles de electroforesis comerciales del mismo lote y el análisis paralelo de varias muestras de diferentes grupos y el uso de controles de calidad aseguran la reproducibilidad. A continuación, las proteínas contenidas en estas bandas/zonas de gel se digieren según un protocolo estandarizado en condiciones controladas. El tratamiento simultáneo de las diferentes muestras biológicas permite reducir considerablemente el impacto de la variabilidad de este paso en el análisis estadístico diferencial final. Al final de este paso, las proteínas se analizan mediante un enfoque LC-ESI MS/MS. Este enfoque LC-ESI MS/MS consiste en separar los péptidos en una columna de separación cromatográfica que se acopla directamente al espectrómetro de masas ESI-MS/M. Este enfoque analítico puede permitir la identificación de más de 1000 proteínas y 5000 péptidos. Este análisis se repite 3 veces por muestra para que la variabilidad analítica se pueda tener en cuenta en los estudios de estadística diferencial. Al final de este protocolo se agrupan los datos brutos de cada zona por muestra y se puede realizar el estudio estadístico diferencial.