Proteomische profilering voor congenitale hernia diafragmatica (pro-CDH)

Zwangere patiënten bij wie een vruchtwaterpunctie zal worden uitgevoerd als onderdeel van de prenatale behandeling van CDH bevestigd door foetale echografie, zullen worden benaderd voor deelname aan het onderzoek. De indicatie vruchtwaterpunctie wordt geïndiceerd volgens de gebruikelijke zorgstandaarden. Kortom, de studie zal geen extra invasieve procedure omvatten. In onze studie zal vruchtwaterpunctie geïndiceerd zijn tijdens de conventionele behandeling van deze patiënten. De behoeften van ons onderzoek zullen niet leiden tot extra amniocenteses, maar gewoon tot een toename van het opgevangen volume vruchtwater. Voor volumes die gewoonlijk van 20 tot 30 ml worden genomen, wordt een extra volume van 5 ml bemonsterd. Dit bemonsteringsvolume zal een zeer beperkte invloed hebben op het welzijn van de moeder en de foetus. Er zal een analyse van het eiwit van het vruchtwater van de patiënten worden uitgevoerd. De relatieve hoeveelheden eiwitten en peptiden in het vruchtwater zullen worden geanalyseerd om variaties in proteomisch profiel te onderzoeken die een verschillende klinische ernst in termen van verdere evolutie kunnen weerspiegelen. Het gebruikelijke beheer van de patiënten en hun kinderen zal niet worden gewijzigd door de procedures die verband houden met het onderzoek.

De eerste stap bestaat uit het uitvoeren van een uitputting van de belangrijkste eiwitten, met name albumine. Per monster wordt een eiwitbepaling uitgevoerd met dezelfde hoeveelheid eiwit (standaardisatie). Deze uitputtingsstap wordt gevolgd door een migratiestap op een gel van 1D-elektroforese. Het doel is zowel om alle verontreinigingen te verwijderen die massaspectrometrische analyse kunnen belemmeren, om de eiwitten te scheiden op basis van hun molecuulgewicht om het eiwitmengsel te vereenvoudigen, en om de heterogeniteit van het monster visueel te controleren. Een differentiële visuele analyse na kleuring zal het mogelijk maken om de zeer variabele zones tussen de groepen patiënten en binnen hetzelfde monster te definiëren. We zullen de interessezone op identieke wijze selecteren voor elk monster en voor de gehele gelbaan. Het gebruik van commerciële elektroforesegels van dezelfde batch en de parallelle analyse van verschillende monsters van verschillende groepen en het gebruik van kwaliteitscontroles zorgen voor reproduceerbaarheid. De eiwitten in deze banden/gelzones worden vervolgens volgens een gestandaardiseerd protocol onder gecontroleerde omstandigheden verteerd. De gelijktijdige behandeling van de verschillende biologische monsters maakt het mogelijk om de impact van de variabiliteit van deze stap in de uiteindelijke differentiële statistische analyse aanzienlijk te verminderen. Aan het einde van deze stap worden de eiwitten geanalyseerd met een LC-ESI MS/MS-benadering. Deze LC-ESI MS/MS aanpak bestaat uit het scheiden van de peptiden op een chromatografische scheidingskolom die direct is gekoppeld aan de ESI-MS/M massaspectrometer. Deze analytische benadering kan de identificatie van meer dan 1000 eiwitten en 5000 peptiden mogelijk maken. Deze analyse wordt per monster 3 keer herhaald, zodat in differentiële statistische studies rekening kan worden gehouden met analytische variabiliteit. Aan het einde van dit protocol worden de ruwe gegevens van elke zone per steekproef samengevoegd en kan de differentiële statistische studie worden uitgevoerd.