Proteomic Profiling für angeborene Zwerchfellhernie (pro-CDH)

Schwangere Patientinnen, bei denen eine Amniozentese als Teil des pränatalen Managements von CDH durchgeführt wird, die durch fetalen Ultraschall bestätigt wurde, werden für die Aufnahme in die Studie angesprochen. Die Indikation zur Amniozentese erfolgt nach den üblichen Behandlungsstandards. Kurz gesagt, die Studie beinhaltet kein zusätzliches invasives Verfahren. In unserer Studie wird eine Amniozentese während der konventionellen Behandlung dieser Patientinnen indiziert sein. Die Erfordernisse unserer Forschung werden nicht zu zusätzlichen Amniozentesen führen, sondern lediglich zu einer Erhöhung der gesammelten Fruchtwassermenge. Bei üblicherweise entnommenen Volumina von 20 bis 30 ml wird ein zusätzliches Volumen von 5 ml entnommen. Dieses Probenahmevolumen wird einen sehr begrenzten Einfluss auf das Wohlbefinden von Mutter und Fötus haben. Es wird eine Analyse des Proteoms des Fruchtwassers der Patientinnen durchgeführt. Die relativen Mengen an Proteinen und Peptiden, die im Fruchtwasser enthalten sind, werden analysiert, um Variationen im proteomischen Profil zu untersuchen, die die unterschiedliche klinische Schwere im Hinblick auf die weitere Evolution widerspiegeln könnten. Die übliche Behandlung der Patienten und ihrer Kinder wird durch die mit der Forschung verbundenen Verfahren nicht verändert.

Der erste Schritt wird darin bestehen, eine Abreicherung der wichtigsten Proteine, insbesondere des Albumins, durchzuführen. Aus der gleichen Proteinmenge wird für jede Probe ein Proteinassay durchgeführt (Standardisierung). Auf diesen Verarmungsschritt folgt ein Migrationsschritt auf einem 1D-Elektrophoresegel. Sein Zweck besteht darin, alle Verunreinigungen zu eliminieren, die die massenspektrometrische Analyse behindern können, die Proteine ​​nach ihrem Molekulargewicht zu trennen, um die Proteinmischung zu vereinfachen, und eine visuelle Kontrolle der Heterogenität der Probe zu haben. Eine differenzielle visuelle Analyse nach dem Färben wird es ermöglichen, die stark variablen Zonen zwischen den Patientengruppen und innerhalb derselben Probe zu definieren. Wir werden die interessierende Zone für jede Probe und für die gesamte Gelspur auf identische Weise auswählen. Die Verwendung handelsüblicher Elektrophoresegele derselben Charge und die parallele Analyse mehrerer Proben unterschiedlicher Gruppen sowie die Verwendung von Qualitätskontrollen gewährleisten die Reproduzierbarkeit. Die in diesen Banden / Gelzonen enthaltenen Proteine ​​werden dann nach einem standardisierten Protokoll unter kontrollierten Bedingungen verdaut. Die gleichzeitige Behandlung der unterschiedlichen biologischen Proben ermöglicht es, den Einfluss der Variabilität dieses Schrittes in der endgültigen differentiellen statistischen Analyse erheblich zu reduzieren. Am Ende dieses Schritts werden die Proteine ​​durch einen LC-ESI-MS/MS-Ansatz analysiert. Dieser LC-ESI-MS/MS-Ansatz besteht darin, die Peptide auf einer chromatographischen Trennsäule zu trennen, die direkt an das ESI-MS/M-Massenspektrometer gekoppelt ist. Dieser analytische Ansatz kann die Identifizierung von mehr als 1000 Proteinen und 5000 Peptiden ermöglichen. Diese Analyse wird 3 Mal pro Probe wiederholt, damit die analytische Variabilität in differentiellen statistischen Studien berücksichtigt werden kann. Am Ende dieses Protokolls werden die Rohdaten jeder Zone stichprobenweise zusammengefasst und die differentielle statistische Untersuchung kann durchgeführt werden.