Proteomické profilování pro vrozenou brániční kýlu (pro-CDH)

K zařazení do studie budou osloveny těhotné pacientky, u kterých bude v rámci prenatálního managementu CDH potvrzená ultrazvukovým vyšetřením plodu provedena amniocentéza. Indikace amniocentézy bude indikována dle obvyklých standardů péče. Stručně řečeno, studie nebude zahrnovat žádný další invazivní postup. V naší studii bude amniocentéza indikována při konvenčním managementu těchto pacientek. Potřeby našeho výzkumu nepovedou k dalším amniocentézám, ale jednoduše ke zvýšení objemu odebrané plodové vody. Další objem 5 ml bude odebrán pro objemy obvykle odebrané od 20 do 30 ml. Tento objem odběru vzorků bude mít velmi omezený dopad na blaho matky a plodu. Bude provedena analýza proteomu plodové vody pacientek. Bude analyzováno relativní množství proteinů a peptidů obsažených v plodové vodě, aby se prozkoumaly variace v proteomickém profilu, které mohou odrážet různou klinickou závažnost z hlediska dalšího vývoje. Obvyklý management pacientů a jejich dětí nebude modifikován postupy souvisejícími s výzkumem.

První krok bude spočívat v provedení deplece hlavních proteinů, zejména albuminu. Proteinový test bude proveden ze stejného množství proteinu pro každý vzorek (standardizace). Po tomto kroku vyčerpání bude následovat krok migrace na gelu 1D elektroforézy. Jeho účelem je jak eliminovat všechny kontaminanty, které mohou bránit analýze hmotnostní spektrometrií, separovat proteiny podle jejich molekulové hmotnosti za účelem zjednodušení proteinové směsi a mít vizuální kontrolu heterogenity vzorku. Diferenciální vizuální analýza po barvení umožní definovat vysoce variabilní zóny mezi skupinami pacientů a v rámci stejného vzorku. Stejným způsobem vybereme zájmovou zónu pro každý vzorek a pro celou gelovou stopu. Použití komerčních elektroforetických gelů ze stejné šarže a paralelní analýza několika vzorků různých skupin a použití kontrol kvality zajišťují reprodukovatelnost. Proteiny obsažené v těchto pásech/gelových zónách jsou poté štěpeny podle standardizovaného protokolu za kontrolovaných podmínek. Současné zpracování různých biologických vzorků umožňuje výrazně snížit dopad variability tohoto kroku v konečné diferenciální statistické analýze. Na konci tohoto kroku jsou proteiny analyzovány přístupem LC-ESI MS/MS. Tento přístup LC-ESI MS / MS spočívá v separaci peptidů na chromatografické separační koloně, která je přímo napojena na ESI-MS / M hmotnostní spektrometr. Tento analytický přístup umožňuje identifikaci více než 1000 proteinů a 5000 peptidů. Tato analýza se opakuje 3krát na vzorek, aby bylo možné vzít v úvahu analytickou variabilitu v diferenciálních statistických studiích. Na konci tohoto protokolu jsou hrubá data každé zóny shromážděna podle vzorku a může být provedena diferenciální statistická studie.