Proteomisk profilering för medfödd diafragmabråck (pro-CDH)

Gravida patienter för vilka fostervattenprov kommer att utföras som en del av den prenatala behandlingen av CDH bekräftad med fetalt ultraljud kommer att kontaktas för att inkluderas i studien. Indikationen på fostervattenprov kommer att indikeras enligt de vanliga vårdstandarderna. Kortfattat kommer studien inte att involvera någon ytterligare invasiv procedur. I vår studie kommer fostervattenprov att indikeras under den konventionella behandlingen av dessa patienter. Behoven av vår forskning kommer inte att leda till ytterligare fostervattenprov, utan helt enkelt en ökning av volymen fostervatten som samlas in. En extra volym på 5 ml kommer att tas för volymer som vanligtvis tas från 20 till 30 ml. Denna provtagningsvolym kommer att ha en mycket begränsad inverkan på moderns och fostrets välbefinnande. En analys av proteomet i fostervattnet hos patienterna kommer att utföras. De relativa mängderna av proteiner och peptider som finns i fostervattnet kommer att analyseras för att utforska variationer i proteomisk profil som kan återspegla olika klinisk gravitation i termer av vidare utveckling. Den vanliga hanteringen av patienterna och deras barn kommer inte att ändras av procedurerna relaterade till forskningen.

Det första steget kommer att bestå i att utföra en utarmning av de viktigaste proteinerna, i synnerhet albumin. En proteinanalys kommer att utföras från samma mängd protein för varje prov (standardisering). Detta utarmningssteg kommer att följas av ett migreringssteg på en gel av 1D-elektrofores. Dess syfte är både att eliminera alla föroreningar som kan hindra masspektrometrianalys, att separera proteinerna enligt deras molekylvikt för att förenkla proteinblandningen och att ha en visuell kontroll av provets heterogenitet. En differentiell visuell analys efter färgning gör det möjligt att definiera de mycket variabla zonerna mellan grupperna av patienter och inom samma prov. Vi kommer att välja zonen av intresse på identiskt sätt för varje prov och för hela gelbanan. Användningen av kommersiella elektroforesgeler av samma sats och parallell analys av flera prover av olika grupper och användningen av kvalitetskontroller säkerställer reproducerbarhet. Proteinerna som finns i dessa band/gelzoner spjälkas sedan enligt ett standardiserat protokoll under kontrollerade förhållanden. Den samtidiga behandlingen av de olika biologiska proverna gör det möjligt att avsevärt minska påverkan av variabiliteten av detta steg i den slutliga differentiella statistiska analysen. I slutet av detta steg analyseras proteinerna med en LC-ESI MS / MS-metod. Denna LC-ESI MS/MS-metod består av att separera peptiderna på en kromatografisk separationskolonn som kopplas direkt till ESI-MS/M-masspektrometern. Detta analytiska tillvägagångssätt kan möjliggöra identifiering av mer än 1000 proteiner och 5000 peptider. Denna analys upprepas 3 gånger per prov så att analytisk variabilitet kan beaktas i differentiella statistiska studier. I slutet av detta protokoll slås rådata från varje zon samman av prov och den differentiella statistiska studien kan utföras.