Profilo proteomico per ernia diaframmatica congenita (pro-CDH)

Le pazienti in gravidanza per le quali verrà eseguita l'amniocentesi come parte della gestione prenatale di CDH confermata dall'ecografia fetale verranno contattate per l'inclusione nello studio. L'indicazione dell'amniocentesi sarà indicata secondo i consueti standard di cura. In breve, lo studio non comporterà alcuna procedura invasiva aggiuntiva. Nel nostro studio, l'amniocentesi sarà indicata durante la gestione convenzionale di questi pazienti. Le esigenze della nostra ricerca non porteranno ad ulteriori amniocentesi, ma semplicemente ad un aumento del volume di liquido amniotico raccolto. Verrà campionato un volume aggiuntivo di 5 ml per volumi normalmente prelevati da 20 a 30 ml. Questo volume di campionamento avrà un impatto molto limitato sul benessere materno e fetale. Verrà effettuata un'analisi del proteoma del liquido amniotico dei pazienti. Le quantità relative di proteine ​​e peptidi contenuti nel liquido amniotico saranno analizzate per esplorare le variazioni nel profilo proteomico che possono riflettere una diversa gravità clinica in termini di ulteriore evoluzione. La gestione abituale dei pazienti e dei loro figli non sarà modificata dalle procedure relative alla ricerca.

Il primo passo consisterà nell'effettuare una deplezione delle principali proteine, in particolare dell'albumina. Verrà effettuato un dosaggio proteico a partire dalla stessa quantità di proteine ​​per ciascun campione (standardizzazione). Questa fase di deplezione sarà seguita da una fase di migrazione su un gel di elettroforesi 1D. Il suo scopo è sia quello di eliminare tutti i contaminanti che possono ostacolare l'analisi di spettrometria di massa, di separare le proteine ​​in base al loro peso molecolare per semplificare la miscela proteica e di avere un controllo visivo dell'eterogeneità del campione. Un'analisi visiva differenziale dopo la colorazione consentirà di definire le zone altamente variabili tra i gruppi di pazienti e all'interno dello stesso campione. Selezioneremo la zona di interesse in maniera identica per ogni campione e per tutta la traccia gel. L'uso di gel per elettroforesi commerciali dello stesso lotto e l'analisi parallela di diversi campioni di gruppi diversi e l'uso di controlli di qualità garantiscono la riproducibilità. Le proteine ​​contenute in queste bande/zone di gel vengono quindi digerite secondo un protocollo standardizzato in condizioni controllate. Il trattamento simultaneo dei diversi campioni biologici consente di ridurre notevolmente l'impatto della variabilità di questa fase nell'analisi statistica differenziale finale. Al termine di questa fase le proteine ​​vengono analizzate mediante un approccio LC-ESI MS/MS. Questo approccio LC-ESI MS/MS consiste nel separare i peptidi su una colonna di separazione cromatografica accoppiata direttamente allo spettrometro di massa ESI-MS/M. Questo approccio analitico può consentire l'identificazione di più di 1000 proteine ​​e 5000 peptidi. Questa analisi viene ripetuta 3 volte per campione in modo che la variabilità analitica possa essere presa in considerazione negli studi statistici differenziali. Al termine di questo protocollo i dati grezzi di ciascuna zona vengono raggruppati per campione e può essere effettuato lo studio statistico differenziale.