先天性横隔膜ヘルニアのプロテオームプロファイリング (pro-CDH)

胎児の超音波によって確認されたCDHの出生前管理の一環として羊水穿刺が行われる妊娠中の患者は、研究に含めるためにアプローチされます。 羊水穿刺の適応は、通常のケア基準に従って示されます。 簡単に言えば、研究には追加の侵襲的処置は含まれません。 私たちの研究では、羊水穿刺は、これらの患者の従来の管理中に示されます。 私たちの研究の必要性は、追加の羊水穿刺につながるのではなく、収集される羊水の量を増やすだけです。 通常 20 ～ 30 ml の容量に対して、さらに 5 ml の容量をサンプリングします。 この量のサンプリングは、母体と胎児の健康に非常に限られた影響しか与えません。 患者の羊水のプロテオームの分析が行われます。 羊水に含まれるタンパク質とペプチドの相対量を分析して、さらなる進化の観点から異なる臨床的重要性を反映している可能性のあるプロテオームプロファイルの変動を調査します。 患者とその子供の通常の管理は、研究に関連する手順によって変更されることはありません。

最初のステップは、主要なタンパク質、特にアルブミンの枯渇を実行することにあります。 タンパク質アッセイは、各サンプルについて同量のタンパク質から実施されます (標準化)。 この枯渇ステップの後に、1D 電気泳動のゲルでの移動ステップが続きます。 その目的は、質量分析分析を妨げる可能性のあるすべての汚染物質を排除すること、タンパク質混合物を簡素化するために分子量に従ってタンパク質を分離すること、およびサンプルの不均一性を視覚的に制御することです。 染色後の微分視覚分析により、患者のグループ間および同じサンプル内の非常に可変性の高いゾーンを定義できます。 各サンプルとゲル トラック全体について、同じ方法で対象ゾーンを選択します。 同じバッチの市販の電気泳動ゲルの使用と、異なるグループのいくつかのサンプルの並行分析と品質管理の使用により、再現性が保証されます。 これらのバンド/ゲルゾーンに含まれるタンパク質は、制御された条件下で標準化されたプロトコルに従って消化されます。 異なる生物学的サンプルを同時に処理することにより、最終的な微分統計分析におけるこのステップの変動性の影響を大幅に減らすことができます。 このステップの最後に、タンパク質は LC-ESI MS/MS アプローチによって分析されます。 この LC-ESI MS/MS アプローチは、ESI-MS/M 質量分析計に直接接続されたクロマトグラフィー分離カラムでペプチドを分離することで構成されます。 この分析的アプローチにより、1000 を超えるタンパク質と 5000 を超えるペプチドを同定できます。 この分析はサンプルごとに 3 回繰り返されるため、微分統計学的研究で分析上のばらつきを考慮することができます。 このプロトコルの最後に、各ゾーンの生データがサンプルごとにプールされ、差分統計調査を実行できます。