Протеомное профилирование при врожденной диафрагмальной грыже (pro-CDH)

Беременные пациентки, которым будет проводиться амниоцентез в рамках пренатального ведения CDH, подтвержденного ультразвуковым исследованием плода, будут рассмотрены для включения в исследование. Показание к амниоцентезу будет указано в соответствии с обычными стандартами медицинской помощи. Вкратце, исследование не будет включать никаких дополнительных инвазивных процедур. В нашем исследовании амниоцентез будет показан во время обычного ведения этих пациентов. Потребности нашего исследования приведут не к дополнительным амниоцентезам, а просто к увеличению объема собираемой амниотической жидкости. Для объемов, обычно отбираемых от 20 до 30 мл, отбирается дополнительный объем 5 мл. Такой объем выборки окажет очень ограниченное влияние на благополучие матери и плода. Будет проведен анализ протеома амниотической жидкости пациенток. Относительное количество белков и пептидов, содержащихся в амниотической жидкости, будет проанализировано для изучения вариаций протеомного профиля, которые могут отражать различную клиническую серьезность с точки зрения дальнейшей эволюции. Обычное ведение пациентов и их детей не будет изменено процедурами, связанными с исследованием.

Первый шаг будет заключаться в проведении истощения основных белков, в частности альбумина. Анализ белка будет проводиться с одинаковым количеством белка для каждого образца (стандартизация). За этим этапом истощения последует этап миграции на геле одномерного электрофореза. Его цель состоит в том, чтобы устранить все примеси, которые могут помешать масс-спектрометрическому анализу, разделить белки в соответствии с их молекулярной массой, чтобы упростить белковую смесь, а также визуально контролировать гетерогенность образца. Дифференциальный визуальный анализ после окрашивания позволит определить сильно изменчивые зоны между группами пациентов и в пределах одного образца. Мы выберем интересующую зону одинаковым образом для каждого образца и для всей гелевой дорожки. Использование коммерческих гелей для электрофореза одной и той же партии и параллельный анализ нескольких образцов из разных групп и использование контроля качества обеспечивают воспроизводимость. Белки, содержащиеся в этих полосах/зонах геля, затем расщепляются в соответствии со стандартизированным протоколом в контролируемых условиях. Одновременная обработка различных биологических образцов позволяет значительно уменьшить влияние изменчивости этого шага на окончательный дифференциально-статистический анализ. В конце этого этапа белки анализируются методом LC-ESI MS/MS. Этот подход LC-ESI MS/MS состоит в разделении пептидов на хроматографической разделительной колонке, которая соединена непосредственно с масс-спектрометром ESI-MS/M. Этот аналитический подход может позволить идентифицировать более 1000 белков и 5000 пептидов. Этот анализ повторяется 3 раза для каждого образца, чтобы можно было учитывать аналитическую изменчивость в дифференциальных статистических исследованиях. В конце этого протокола необработанные данные каждой зоны объединяются по образцу, и может быть проведено дифференциальное статистическое исследование.