Platforma PAH do głębokiego fenotypowania osób koreańskich (PHOENIKS)

Cele badania Obecne badanie to wieloośrodkowy rejestr i biobank oparty na populacjach Korei Południowej w celu zbudowania bazy danych do wyjaśnienia molekularnych i genetycznych modyfikatorów WWA. Ostatecznym celem jest wykorzystanie głębokich danych fenotypowych do przewidywania rokowania oraz odkrywania biomarkerów i terapii celowanych.

Badana próbka Obecne badanie początkowo wykluczy najczęstszą postać PAH w Korei, TNP związaną z chorobą tkanki łącznej (CTD), i skupi się na diagnostyce i głębokim fenotypowaniu pacjentów z idiopatycznym PAH (IPAH) i dziedzicznym PAH (HPAH). Kryteriami włączenia są: (1) wiek powyżej 18 lat, (2) średnie ciśnienie tętnicze płucne 25 mmHg lub wyższe potwierdzone przez cewnikowanie prawego serca (RHC), (3) płucny opór naczyniowy ≥ 240 dyn∙s∙cm- 5, (4) ciśnienie rozkurczowe lewej komory (LVDEP) lub ciśnienie zaklinowania w kapilarach płucnych (PCWP) ≤ 15mmHg. Kryteriami wykluczenia są: (1) pacjenci z PAH wywołanym lekami, (2) CTD, zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV), nadciśnieniem wrotnym, wrodzoną wadą serca lub PAH związanym ze schistosomatozą, (3) długotrwała odpowiedź na wapń blokery kanałów, (4) pacjenci z TNP z jawnymi cechami zajęcia naczyń włosowatych żylnych, pozostawiając pacjentów z IPAH i HPAH w grupie 1 PH do oceny. HPAH zostanie zdiagnozowana poprzez identyfikację pacjentów z heterozygotycznymi patogennymi wariantami określonych genów, takich jak BMPR2, ACVRL1, ENG, CAV1, SMAD1, SMAD4, SMAD9, KCNK3 i EIF2AK4. Pacjenci bez określonej mutacji genetycznej zostaną następnie sklasyfikowani jako pacjenci z IPAH. Zostaną również przeanalizowane dane genomowe członków rodziny z 3 rodowodów pacjenta z HPAH. Wszystkie dane kliniczne i biologiczne zostaną przekazane do dostosowanego internetowego formularza zgłoszenia przypadku zwanego systemem iCReaT zarządzanym przez Koreańskie Centrum Kontroli Chorób. Wszystkie zebrane próbki biologiczne będą przechowywane w głównym magazynie Koreańskiego Narodowego Instytutu Zdrowia. Chociaż planuje się, że obecna analiza będzie ograniczona do pacjentów z IPAH i HPAH, nasz komitet sterujący planuje rozszerzyć ją na wszystkie typy PAH w kolejnych badaniach. Badanie to zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną każdej uczestniczącej instytucji i było zgodne z Deklaracją Helsińską (6. rewizja). Każdy pacjent otrzyma świadomą zgodę.

Dane wyjściowe i pobieranie próbek biologicznych Dane wyjściowe od zarejestrowanych pacjentów w 16 szpitalach regionalnych będą obejmować: klasyfikację czynnościową WHO, 6-minutowy test marszu, próbkę krwi, elektrokardiogram, zdjęcie rentgenowskie klatki piersiowej, echokardiografię, opcjonalny test wysiłkowy układu oddechowego i sercowo-naczyniowego , opcjonalnie MRI serca i RHC. Szczegółowe informacje o poszczególnych egzaminach zawiera Tabela 2. Zarejestrowany pacjent będzie regularnie obserwowany w celu uzyskania dalszych danych i pobrania biopróbek.

Z próbki krwi pacjenta DNA, RNA, surowica, osocze i komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z kożuszka zostaną oddzielone i wyekstrahowane do dalszego przechowywania i badań. W przypadku próbki DNA, 2,5 ml pełnej krwi będzie przechowywane w probówce DNA genu PAX w miejscu pobrania i zostanie przeniesione do głównego ośrodka w temperaturze 4~10 C. W głównym ośrodku będzie wtedy: przenieść do krioprobówki o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -70~80C. W celu pobrania RNA pacjenta, 2,5 ml pełnej krwi zostanie pobrane do probówki PAX z genem RNA i zostanie wysłane do głównego ośrodka w temperaturze 4~10°C, a następnie przeniesione do krioprobówki w celu przechowywania w temperaturze -70°C 80C.

Pobrana zostanie również surowica pacjenta, osocze i kożuszek leukocytarny. W odpowiednich miejscach pobierania surowica zostanie pobrana do probówki do separacji surowicy, a po 30 minutach nakłucia żyły zostanie odwirowana i przechowywana w temperaturze -20°C. W przypadku osocza pacjenta probówka do przygotowania komórek zostanie wykorzystana w ciągu 2 godzin od pobrania krwi. Następnie każda próbka będzie gotowa do przechowywania w temperaturze -20°C poprzez traktowanie próbek przeciwciałem typu surowicy ludzkiej, DMSO i podłożem do zamrażania. Aby oddzielić i wyekstrahować PBMC, należy oddzielić białą warstwę kożuszka leukocytarnego i przechowywać ją w 1,5 ml probówce z podłożem do zamrażania w temperaturze -20°C. Zebrane dane podstawowe zostaną następnie poddane procesowi oczyszczania i zostanie przeprowadzona dalsza ocena ich jakości. Ponadto pięciu pacjentów zostanie wybranych do sekwencjonowania całego genomu. Wszystkie pobrane biopróbki zostaną przekazane do magazynu ośrodka NIH i będą dalej wykorzystywane do badań multiomicznych w celu głębokiego fenotypowania próbek pacjenta.

Kontrola pacjenta Wszyscy pacjenci będą kontrolowani co najmniej dwa razy w roku, przy czym oczekuje się, że wskaźnik obserwacji wyniesie 80%. W drugim i trzecim roku rejestracja pacjentów i gromadzenie danych będą kontynuowane według tego samego protokołu. Aby zachować wiarygodność zebranych danych, komitet sterujący będzie stale monitorował i kontrolował zebrane dane. Protokół może zostać dopracowany po ocenie danych z poprzedniego roku. Ponadto opracowane zostaną skuteczne strategie zarządzania danymi, w tym wytyczne dotyczące standaryzacji pomiarów ciała pacjenta i próbki krwi. Dziesięć próbek pacjentów zostanie wybranych do sekwencjonowania nowej generacji, a my będziemy wykorzystywani do odkrywania nowych mutacji genetycznych.

Analiza mutacji genetycznych w trzech rodowodach pacjentów z HPAH W celu określenia pacjentów z HPAH, zostanie przeprowadzone rodzinne badanie genetyczne. Oceniony zostanie trzypokoleniowy rodowód każdego pacjenta z PAH z lub bez mutacji BMPR2, ACVRL1, ENG, CAV1, SMAD1, SMAD4, SMAD9, KCNK3 i/lub EIF2AK4. Próbki krwi od członków rodzin pacjentów z HPAH będą pobierane do genetycznych badań przesiewowych.