La plataforma PAH para el fenotipado profundo en sujetos coreanos (PHOENIKS)

Objetivos del estudio El estudio actual es un registro multicéntrico y un biobanco basado en poblaciones de Corea del Sur para construir una base de datos para la elucidación de los modificadores genéticos y moleculares de la HAP. El objetivo final es utilizar datos fenotípicos profundos para la predicción del pronóstico y el descubrimiento de biomarcadores y terapias dirigidas.

Muestra del estudio El estudio actual excluirá inicialmente la forma más frecuente de HAP en Corea, la HAP relacionada con la enfermedad del tejido conectivo (CTD), y se centrará en el diagnóstico y el fenotipado profundo de los pacientes con HAP idiopática (IPAH) y HAP hereditaria (HPAH). Los criterios de inclusión son los siguientes: (1) mayor de 18 años, (2) presión arterial pulmonar media de 25 mmHg o superior confirmada por cateterismo cardíaco derecho (CCD), (3) resistencia vascular pulmonar ≥ 240 dinas∙s∙cm- 5, (4) presión diastólica del ventrículo izquierdo (LVDEP) o presión de enclavamiento capilar pulmonar (PCWP) ≤ 15 mmHg. Los criterios de exclusión son: (1) pacientes con HAP inducida por fármacos, (2) CTD, infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), hipertensión portal, cardiopatía congénita o HAP asociada a esquistosomiasis, (3) respondedores a largo plazo al calcio bloqueadores de canales, (4) pacientes con PAH con características manifiestas de afectación de los capilares venosos, dejando a los pacientes con HAPI y HPAH entre el grupo 1 de HP a evaluar. La HPAH se diagnosticará mediante la identificación de pacientes con variantes patogénicas heterocigóticas de genes predeterminados como BMPR2, ACVRL1, ENG, CAV1, SMAD1, SMAD4, SMAD9, KCNK3 y EIF2AK4. Los pacientes sin una mutación genética específica se clasificarán entonces como pacientes con HAPI. También se analizarán los datos genómicos de los miembros de la familia en 3 genealogías de un paciente con HPAH. Todos los datos clínicos y biológicos se enviarán a un formulario personalizado de informe de casos basado en la web llamado sistema iCReaT administrado por el Centro Coreano para el Control de Enfermedades. Todas las muestras biológicas recolectadas se almacenarán en el almacenamiento principal del Instituto Nacional de Salud de Corea. Aunque se planea que el análisis actual se limite a pacientes con HAPI y HPAH, nuestro comité directivo planea expandirse a todos los tipos de PAH en estudios posteriores. Este estudio fue aprobado por el comité de ética institucional de cada una de las instituciones participantes y cumplió con la Declaración de Helsinki (6ª revisión). Se recibirá un consentimiento informado por parte de cada paciente.

Datos de referencia y recolección de muestras biológicas Los datos de referencia de los pacientes registrados en los 16 hospitales regionales incluirán lo siguiente: clasificación funcional de la OMS, prueba de caminata de 6 minutos, muestra de sangre, electrocardiograma, radiografía de tórax, ecocardiografía, prueba de ejercicio cardiovascular pulmonar opcional , resonancia magnética cardíaca opcional y RHC. La información detallada de cada examen se especifica en la Tabla 2. El paciente registrado será objeto de un seguimiento regular para obtener más datos y la recogida de muestras biológicas.

Con la muestra de sangre del paciente, el ADN, el ARN, el suero, el plasma y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la capa leucocitaria se separarán y se extraerán para almacenamiento y estudios adicionales. Para la muestra de ADN, se almacenarán 2,5 ml de sangre total en un tubo de ADN del gen PAX en el sitio de recolección y se llevará al centro principal a 4~10 C. En el centro principal, entonces, ser transferido a un criotubo de 2ml para ser almacenado a -70~80C. Para la recolección de ARN del paciente, se recolectarán 2,5 ml de sangre completa en el tubo de ARN del gen PAX y se enviará al centro principal a 4 ~ 10 C, que también se transferirá a un criotubo para almacenarlo a -70 ~ 80C.

También se recolectarán el suero, el plasma y la capa leucocitaria del paciente. En los sitios de recolección respectivos, el suero se recolectará en un tubo de separación de suero y, después de 30 minutos de venopunción, se centrifugará y almacenará a -20C. Para el plasma del paciente, el tubo de preparación de células se utilizará dentro de las 2 horas posteriores a la extracción de sangre. Luego, cada muestra estará lista para ser almacenada a -20C mediante el tratamiento de las muestras con anticuerpos de tipo suero humano, DMSO y medio de congelación. Para separar y extraer PBMC, la capa leucocítica blanca se separará y se almacenará en un tubo de 1,5 ml con un medio de congelación a -20 °C. Los datos de línea de base recopilados luego pasarán por un proceso de limpieza y se realizará una evaluación adicional de su calidad. Además, se seleccionarán cinco pacientes para realizar una secuenciación del genoma completo. Todas las muestras biológicas recolectadas se donarán al centro de almacenamiento de los NIH y se utilizarán para estudios multiómicos con el fin de profundizar el fenotipo de las muestras del paciente.

Seguimiento del paciente Todos los pacientes serán seguidos dos o más veces al año, con una tasa de seguimiento esperada del 80 %. Durante el segundo y tercer año se continuará con el registro de pacientes y la recolección de datos con el mismo protocolo. Para mantener la credibilidad de los datos recopilados, el comité directivo monitoreará y auditará continuamente los datos recopilados. El protocolo puede elaborarse aún más después de evaluar los datos del año anterior. Además, se desarrollarán estrategias eficaces de gestión de datos, incluida una guía para estandarizar las medidas corporales y las muestras de sangre de los pacientes. Se seleccionarán diez muestras de pacientes para una secuenciación de próxima generación, y se utilizarán para descubrir nuevas mutaciones genéticas.

Análisis de mutaciones genéticas en tres genealogías para pacientes con HPAH Para determinar los pacientes con HPAH, se realizará un estudio genético familiar. Se evaluará un pedigrí de tres generaciones para cada paciente con PAH con o sin la existencia de una mutación BMPR2, ACVRL1, ENG, CAV1, SMAD1, SMAD4, SMAD9, KCNK3 y/o EIF2AK4. Se recolectarán muestras de sangre de familiares de pacientes con HPAH para un examen genético.