Die PAH-Plattform für die tiefe Phänotypisierung bei koreanischen Probanden (PHOENIKS)

Studienziele Die aktuelle Studie ist ein multizentrisches Register und eine Biobank auf der Grundlage südkoreanischer Populationen, um eine Datenbank zur Aufklärung der molekularen und genetischen Modifikatoren von PAH aufzubauen. Das ultimative Ziel ist es, tiefe phänotypische Daten für die Prognosevorhersage und die Entdeckung von Biomarkern und zielgerichteten Therapien zu nutzen.

Studienbeispiel Die aktuelle Studie wird zunächst die häufigste Form der PAH in Korea, die durch Bindegewebserkrankungen (CTD) bedingte PAH, ausschließen und sich auf die Diagnose und tiefe Phänotypisierung von Patienten mit idiopathischer PAH (IPAH) und vererbbarer PAH (HPAH) konzentrieren. Die Einschlusskriterien lauten wie folgt: (1) über 18 Jahre alt, (2) mittlerer pulmonalarterieller Druck von 25 mmHg oder höher, bestätigt durch Rechtsherzkatheter (RHC), (3) pulmonaler Gefäßwiderstand ≥ 240 dynes∙s∙cm- 5, (4) linksventrikulärer diastolischer Druck (LVDEP) oder pulmonaler Kapillarkeildruck (PCWP) ≤ 15 mmHg. Ausschlusskriterien sind: (1) Patienten mit arzneimittelinduzierter PAH, (2) CTD, Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV), portaler Hypertonie, angeborener Herzerkrankung oder Bilharziose-assoziierter PAH, (3) Langzeitansprechen auf Kalzium Kanalblocker, (4) PAH-Patienten mit offensichtlichen Merkmalen einer venösen Kapillarbeteiligung, wobei IPAH- und HPAH-Patienten in Gruppe 1 von PH zu bewerten sind. HPAH wird diagnostiziert, indem Patienten mit heterozygoten pathogenen Varianten von vorbestimmten Genen wie BMPR2, ACVRL1, ENG, CAV1, SMAD1, SMAD4, SMAD9, KCNK3 und EIF2AK4 identifiziert werden. Patienten ohne eine bestimmte genetische Mutation werden dann als IPAH-Patienten kategorisiert. Die genomischen Daten von Familienmitgliedern aus 3 Stammbäumen eines HPAH-Patienten werden ebenfalls analysiert. Alle klinischen und biologischen Daten werden an ein angepasstes webbasiertes Fallberichtsformular namens iCReaT-System gemeldet, das vom Korean Center for Disease Control verwaltet wird. Alle entnommenen Bioproben werden im Hauptlager des Korean National Institute of Health gelagert. Obwohl geplant ist, die aktuelle Analyse auf IPAH- und HPAH-Patienten zu beschränken, plant unser Lenkungsausschuss, sie in späteren Studien auf alle Arten von PAH auszudehnen. Diese Studie wurde von der institutionellen Ethikkommission jeder teilnehmenden Institution genehmigt und entspricht der Deklaration von Helsinki (6. Überarbeitung). Eine Einverständniserklärung wird von jedem Patienten erhalten.

Baseline-Daten und Sammlung von Bioproben Die Baseline-Daten der registrierten Patienten in den 16 regionalen Krankenhäusern umfassen Folgendes: WHO-Funktionsklassifikation, 6-Minuten-Gehtest, Blutprobe, Elektrokardiogramm, Röntgen-Thorax, Echokardiographie, optionaler Lungen-Kardio-Belastungstest , optional Herz-MRT und RHC. Detaillierte Informationen zu den einzelnen Prüfungen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Der registrierte Patient wird regelmäßig für weitere Daten und die Entnahme von Bioproben nachuntersucht.

Mit der Blutprobe des Patienten werden DNA, RNA, Serum, Plasma und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) aus dem Buffy Coat getrennt und für weitere Lagerung und Untersuchungen extrahiert. Für die DNA-Probe werden 2,5 ml des Vollbluts in einem PAX-Gen-DNA-Röhrchen an der Entnahmestelle aufbewahrt und bei 4 bis 10 °C zum Hauptzentrum transportiert. Im Hauptzentrum wird es dann in ein 2-ml-Kryoröhrchen überführt und bei -70 bis 80 °C gelagert werden. Für die RNA-Sammlung des Patienten werden 2,5 ml Vollblut im PAX-Gen-RNA-Röhrchen gesammelt und bei 4 bis 10 ° C an das Hauptzentrum gesendet, das auch weiter in ein Kryoröhrchen überführt wird, um es bei -70 ° C zu lagern 80C.

Serum, Plasma und Buffy Coat des Patienten werden ebenfalls gesammelt. An den jeweiligen Entnahmestellen wird das Serum in einem Serumtrennröhrchen gesammelt und nach 30-minütiger Venenpunktion zentrifugiert und bei -20 °C gelagert. Für das Plasma des Patienten wird das Zellvorbereitungsröhrchen innerhalb von 2 Stunden nach der Blutentnahme verwendet. Dann ist jede Probe bereit, bei -20°C gelagert zu werden, indem die Proben mit Antikörpern vom Typ Humanserum, DMSO und Gefriermedium behandelt werden. Um PBMC abzutrennen und zu extrahieren, wird die weiße Buffy-Coat-Schicht abgetrennt und in einem 1,5-ml-Röhrchen mit einem Gefriermedium bei -20 °C gelagert. Die gesammelten Basisdaten werden dann einem Bereinigungsprozess unterzogen, und es erfolgt eine weitere Bewertung ihrer Qualität. Darüber hinaus werden fünf Patienten ausgewählt, um eine Gesamtgenomsequenzierung durchzuführen. Alle gesammelten Bioproben werden an das Lager des NIH-Zentrums gespendet und weiter für Multi-Omics-Studien verwendet, um die Proben des Patienten tiefgehend zu phänotypisieren.

Nachsorge der Patienten Alle Patienten werden zweimal oder öfter im Jahr nachuntersucht, mit einer erwarteten Nachsorgerate von 80 %. Im zweiten und dritten Jahr werden das Patientenregister und die Datenerhebung mit demselben Protokoll fortgesetzt. Um die Glaubwürdigkeit der gesammelten Daten zu wahren, wird der Lenkungsausschuss die gesammelten Daten kontinuierlich überwachen und prüfen. Das Protokoll kann nach Auswertung der Vorjahresdaten weiter ausgearbeitet werden. Darüber hinaus werden effektive Datenmanagementstrategien entwickelt, einschließlich einer Richtlinie zur Standardisierung der Körpermaße und Blutproben von Patienten. Zehn Patientenproben werden für eine Sequenzierung der nächsten Generation ausgewählt, und wir werden bei der Entdeckung neuer genetischer Mutationen eingesetzt.

Genetische Mutationsanalyse über drei Stammbäume für HPAH-Patienten Um Patienten mit HPAH zu bestimmen, wird eine familiäre genetische Studie durchgeführt. Ein Drei-Generationen-Stammbaum für jeden PAH-Patienten mit oder ohne Vorhandensein einer BMPR2-, ACVRL1-, ENG-, CAV1-, SMAD1-, SMAD4-, SMAD9-, KCNK3- und/oder EIF2AK4-Mutation wird ausgewertet. Blutproben von Familienmitgliedern von Patienten mit einer HPAH werden für ein genetisches Screening gesammelt.