Osocze i bliznowacenie wrzodów cukrzycowych

Stopa cukrzycowa jest wyniszczającym powikłaniem cukrzycy, któremu towarzyszą rozwijające się owrzodzenia klatki piersiowej, które często prowadzą do amputacji. Rocznie ponad milion ludzi traci z tego powodu część składek kończyn. Owrzodzenia stóp są najczęstszym powikłaniem pacjentów z cukrzycą i uważa się, że dotykają do 15% z nich przez całe życie (8, 9).

Owrzodzenia, które nie postępują przez okres około 4 tygodni, należy poddać ponownej ocenie. Kilka badań wykazało również, że przewlekłe owrzodzenia ogólnie, aw szczególności owrzodzenia stopy cukrzycowej, mają zmiany w proliferacji fibroblastów, równowadze między czynnikami wzrostu, metaloproteinazą (MMP) i przebudową macierzy pozakomórkowej (2, 8, 9).

Zmiany poziomu metaloproteinazy macierzy, a także interleukiny i prokalcytoniny regulowanej po aktywacji, normalnej ekspresji i wydzielaniu komórek T, zostały skorelowane z gojeniem się ran (10). Metaloproteinaza i jej regulatory, inhibitory tkankowe metaloproteinazy macierzy (TIMPes) są niezbędne do prawidłowego gojenia się rany na odpowiednim poziomie, we właściwym miejscu i przez ściśle określony czas. Przypuszcza się, że aspekty te nie są spełnione w przypadku ran przewlekłych, takich jak wrzody pochodzenia cukrzycowego (11).

Autologiczne osocze bogate w czynniki wzrostu (PRFC) zastosowane w miejscu rany uwalnia dziesiątki czynników wzrostu, chemokin i cytokin, które regulują angiogenezę, nabłonkowanie i regenerację (15, 16). Są wydzielane przez granulki i stwierdzono, że przyczyniają się do zwiększenia szybkości naturalnego procesu gojenia wraz ze spadkiem czasu (4).

Osocze bogatopłytkowe definiuje się jako autologiczną lub allogeniczną pochodną płytek krwi o stężeniu płytek krwi wyższym niż wyjściowe. Autologiczne osocze bogate w czynnik wzrostu (PRFC) to frakcja osocza pochodząca z krwi autologicznej, która po obróbce przez wirowanie ma wyższe stężenie płytek krwi i wyższe niż wyjściowe czynniki wzrostu (8). Istnieją dwie techniki pozyskiwania: zamknięta i otwarta. W przypadku otrzymywania „techniką zamkniętą” zastosowana metoda musi być zgodna z instrukcjami opisanymi w zestawach jednorazowych stosowanych w każdym komercyjnym systemie. „Technika otwarta” pozwala natomiast z mniejszych objętości krwi i prostego sprzętu uzyskać wyższe stężenie czynników wzrostu (25).

Ze względu na swój autologiczny charakter, PRFC jest produktem bezpiecznym, który z definicji nie stwarza potencjalnego ryzyka przenoszenia chorób związanych z wykorzystaniem materiału krwi dawcy. W odniesieniu do potencjału onkogennego PRFC, który sugerowali niektórzy autorzy, nie ma dostępnych dowodów na jego poparcie.

Kluczowe uwalniane czynniki obejmują płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF), beta-transformujący czynnik wzrostu (TGF-b), czynnik płytkowy 4 (PF4), interleukinę 1 (IL-1), czynnik angiogenny pochodzący z płytek krwi (PDAF), czynnik wzrostu (VEGF), naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), płytkopochodny czynnik wzrostu śródbłonka (PDEGF), czynnik wzrostu komórek nabłonka (ECGF), insulina (IGF-1), osteokalcyna, osteonektyna, fibrynogen, fibronektyna i trombospondyna (TSP) (11,27). Białka te wydzielane przez aktywowane płytki krwi wpływają na wiele aspektów gojenia.

PRFC był używany w różnych obszarach medycyny regeneracyjnej do poprawy procesów gojenia się ran z wieloma zastosowaniami klinicznymi w różnych dziedzinach medycyny: chirurgii ogólnej, traumatologii i medycynie sportowej, stomatologii i chirurgii, chirurgii plastycznej i rekonstrukcyjnej, dermatologii, neurologii i neurochirurgii (28, 8). ).

Historia opiera się na wdrażaniu nowych strategii leczenia owrzodzeń stopy cukrzycowej z wykorzystaniem czynników wzrostu i osocza bogatopłytkowego (15,16,17,20,27,28).

Pomimo tych solidnych podstaw biologicznych, wyniki leczenia owrzodzeń skóry płytkopochodnymi czynnikami wzrostu są zróżnicowane i istnieje stosunkowo niewiele badań kontrolowanych. Istnieje niejasność co do przydatności osocza bogatopłytkowego, ponieważ w badaniach, w których je oceniano, stosowano szeroką gamę produktów (różne stężenia płytek krwi i leukocytów, różne techniki i częstotliwości stosowania, różne rodzaje leczonych urazów, bardzo niejednorodne i różne punkty końcowe), co prawie uniemożliwia porównanie danych i wyciągnięcie wniosków (29, 30).

Istnieją recenzje, które oceniają dotychczasowe wyniki dotyczące efektów, jakie te biologiczne suplementy z płytkami krwi oferują jako adiuwanty w gojeniu się ran i gojeniu. Metaanaliza opublikowana w 2016 roku, która obejmowała 10 randomizowanych badań klinicznych oceniających wpływ PRFC na gojenie się ran przewlekłych. Trzy z tych randomizowanych badań klinicznych dotyczyły owrzodzeń pochodzenia cukrzycowego, a trzy badania dotyczyły żylnych owrzodzeń podudzi. Ogólna analiza nie rzuciła światła na skuteczność PRFC, ale wyniki wskazują, że autologiczny PRFC może poprawić gojenie owrzodzeń cukrzycowych w porównaniu ze standardową opieką, chociaż wartość dowodów jest niska (46).

Dlatego uważamy za celowe przeprowadzenie badań, które pozwolą w sposób jasny i prosty, ale wyczerpujący opisać wpływ zastosowania PRFC na gojenie się przewlekłych owrzodzeń pochodzenia cukrzycowego trudnych do leczenia.

Hipoteza badawcza. 4-tygodniowa śródskórna aplikacja osocza bogatego w czynniki wzrostu (PRFC) skraca czas gojenia przewlekłych owrzodzeń trudnego do leczenia pochodzenia cukrzycowego, zmniejsza wielkość urazu, wywołuje zmiany na poziomie histologicznym oraz przyczynia się do zmniejszenia dolegliwości bólowych i poprawy jakość życia pacjenta w porównaniu z najlepszym dostępnym leczeniem.

Materiał i metody. Randomizowane badanie kliniczne przeprowadzone u pacjentów z przewlekłymi owrzodzeniami (powstałymi ponad 4 tygodnie) pochodzenia cukrzycowego, którzy zgłaszają się do Kliniki Rany Regionalnego Szpitala Ogólnego w León w celu oceny i opieki.

Liczebność próby obliczono dla 20 pacjentów na grupę (grupa kontrolna i grupa badana), aby wykryć co najmniej 50% różnicę w zmniejszeniu wymiarów przewlekłego owrzodzenia na końcu manewru, ze statystyczną istotnością 0,05% i moc 80%. Pacjenci będą wybierani przez nieprobabilistyczne pobieranie próbek dla wygody.

Procedura. Pacjenci zostaną włączeni do badania za pośrednictwem Kliniki Rany i Oddziału Hematologii Regionalnego Szpitala Ogólnego w León, gdzie zostaną zaproszeni do udziału w badaniu, po wyjaśnieniu procedury, a ci, którzy zaakceptują zaproszenie, poproszą o podpisanie świadoma zgoda. Pacjenci, którzy wyrażą zgodę na udział w badaniu, zostaną poddani ocenie metabolicznej i hematologicznej przez oddział hematologii tego samego szpitala. Zostaną wykonane badania laboratoryjne (biometria hematyczna, chemia krwi, HbA1C, profil lipidowy i czasy krzepnięcia). Pacjenci będą przyjmowani 1 raz w tygodniu w Klinice Rany, a zaawansowane leczenie owrzodzeń będzie wykonywane w obu grupach obejmujące gojenie roztworem fizjologicznym i antyseptycznym, oczyszczenie biofilmu, jak również obumarłą tkankę, zamykanie gazą niewchłaniającą, suchą gazą i bandaż w obu grupach. Grupa badana będzie miała również śródskórną aplikację PRFC po wygojeniu. Grupa badana zostanie również pobrana jako biopsja metodą stempla (5 mm x 5 mm, biorąc pod uwagę niewielką część) w pierwszym tygodniu (przed zastosowaniem PRFC) i pod koniec leczenia (1 tydzień po ostatnim zastosowaniu prFC). U pacjentów, u których osiągnięto całkowite zamknięcie owrzodzenia, nie wykonuje się końcowej biopsji, aby zapobiec dalszemu powstawaniu owrzodzenia. Ma to na celu określenie wpływu osocza bogatego w czynniki wzrostu na poziomie histologicznym na owrzodzenia pochodzenia cukrzycowego. Procedury takie wykonuje student. Podczas każdej wizyty, przed zakończeniem leczenia, dokonany zostanie pomiar owrzodzenia w jego większej i najmniejszej średnicy oraz obliczona zostanie powierzchnia owrzodzenia za pomocą komputerowej planimetrii. Dokona tego chirurg naczelny i odpowiedzialny za Klinikę Leczenia Ran, który będzie zaślepiony, do której grupy należy każdy pacjent). Każdego tygodnia każdy pacjent będzie również oceniany za pomocą Analogowej Skali Bólu Wizualnego (EVA) i Kwestionariusza Stylu Życia SF-12. Obydwie skale z obowiązującą ważnością (49, 50). W czasie trwania badania cotygodniowe fotograficzne monitorowanie owrzodzeń będzie przeprowadzane w celu oceny ich ewolucji i odpowiedzi na leczenie u każdego pacjenta. Zarówno oceny, jak i obserwacja fotograficzna zostaną przeprowadzone przez studenta.

Technika wirowania i otrzymywania PRFC. Po 8 godzinach postu zostanie pobrana próbka krwi (20 cm3) przez nakłucie tętnicy łokciowej, która zostanie pobrana do sterylnych probówek z cytrynianem sodu o stężeniu 3,8% jako antykoagulantem. Próbka zostanie wykorzystana do wykonania wstępnego zliczenia płytek krwi. Pozostała część próbki krwi będzie wirowana przy 3200 obrotach na minutę (rpm) przez 15 minut w temperaturze pokojowej; rozdzielanie przez pipetowanie otrzymanego osocza (około 3-4 ml) o zmiennej zawartości płytek krwi, które będzie ponownie wirowane przez 8 minut przy 1800 obr./min, w temperaturze pokojowej. Następnie, poprzez dokładne pipetowanie, frakcje otrzymane z osocza należy oddzielić od góry i zebrać do sterylnych probówek oddzielonych w taki sposób, aby ostatnia otrzymana frakcja (około 1-5 do 2 ml i umieszczona w dolnej części probówki) odpowiadające osoczu bogatemu w czynniki wzrostu lub PRFC (26). Z tej frakcji PRFC zostanie pobrana próbka 0,5 ml w celu oznaczenia liczby płytek krwi i określenia wydajności płytek krwi po wirowaniu u każdego pacjenta i zastosowania. Ta wartość zostanie zarejestrowana w celu określenia wzrostu stężenia płytek krwi u każdego pacjenta. Pozostała frakcja (1,5 ml) zostanie podana poprzez wstrzyknięcie śródskórne natychmiast po pobraniu. Ta procedura zostanie przeprowadzona w Laboratorium Szpitala Ogólnego w León przez tę samą osobę przeszkoloną i zaznajomioną z procedurą przez cały okres badania. Cytrynian wapnia nie będzie dodawany jako aktywator, ponieważ zgodnie z literaturą przyjmuje się, że aktywacja czynników wzrostu następuje w tkankach miękkich po kontakcie PRFC z włóknami kolagenowymi.

TECHNICZNE ZASTOSOWANIE PRFC Po wygojeniu owrzodzenia w sposób opisany powyżej i przed nałożeniem gazy grupa badana zostanie zastosowana na 2/3 PRFC uzyskanego przez śródskórne wstrzyknięcie w tod lub obwód owrzodzenia za pomocą strzykawki o pojemności 3 cm3 i igła podskórna. Pozostała jedna trzecia zostanie nałożona na łożysko owrzodzenia techniką kroplową. Następnie zostanie na nią nałożona niewchłaniająca gaza, a na koniec pokryta wysuszoną gazą i bandażem. Zostaną one usunięte do następnej aplikacji PRFC (1 tydzień).

Analiza statystyczna. Zmienne ciągłe będą przedstawiane jako średnie +/- odchylenia standardowe, a jakościowe jako częstości i procenty. Wykonamy Student T dla wstępnego porównania badanych grup i X2 według typu zmiennej. Aby przetestować naszą hipotezę, wykonamy ANOVA powtarzanych pomiarów i test post hoc Tukeya. Analiza wielokrotnej korelacji określi możliwy związek innych czynników wpływających na czas gojenia się owrzodzeń.