Interwencja dietetyczna z EVOO o wysokiej zawartości fenolu w CLL

Oliwa z oliwek extra virgin (EVOO) jest głównym składnikiem diety śródziemnomorskiej. W oliwie z oliwek wykryto ponad 200 różnych związków chemicznych, w tym kwasy tłuszczowe, sterole, karotenoidy, terpenoidy, flawonoidy, tokoferole i polifenole z oliwek. Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia zawiera wiele ważnych składników fenolowych, głównie odpowiadających związkom tyrozol, hydroksytyrozol, oleocanthal (OC), oleacyna (OL), ligstrozyd i aglikony oleuropeiny. Wśród tych fenoli z oliwek, oleocanthal, dialdehydowa forma aglikonu dikarboksymetylo-listrozydowego, który został wyizolowany z EVOO, wykazuje szeroki zakres efektów biologicznych, w tym działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne, przeciwnowotworowe, neuroprotekcyjne i przeciwcukrzycowe iz tego powodu przyciągnął większą uwagę naukowców.

Przewlekła białaczka limfocytowa (PBL), najczęściej diagnozowana białaczka dorosłych w krajach zachodnich, odpowiada za około 1 na 4 przypadki wszystkich białaczek. Charakteryzuje się gromadzeniem monoklonalnych limfocytów B w szpiku kostnym, krwi obwodowej, tkankach limfatycznych i śledzionie, często przebiega bezobjawowo i wolno się rozwija. Pacjenci z PBL nie zawsze wymagają natychmiastowej terapii. Jednak pacjenci, u których pojawiają się objawy, mają przybliżoną medianę przeżycia od 18 miesięcy do 6 lat, w zależności od stadium klinicznego. Kryteria rozpoznania PBL to monoklonalne limfocyty B ≥5000 limfocytów/ml we krwi obwodowej przez co najmniej 3 miesiące, prolimfocyty ≤55%, koekspresja klastra różnicowania (CD)5 i antygenów powierzchniowych limfocytów B CD 19, CD 20 i CD 23, niskie poziomy CD 20, CD 79b i niska ekspresja immunoglobulin powierzchniowych (sIg) oraz restrykcja łańcucha lekkiego kappa lub lambda. Standardowymi procedurami klinicznymi służącymi do szacowania rokowania są systemy oceny stopnia zaawansowania klinicznego opracowane przez Rai i wsp. oraz Bineta i wsp.

Poziom apoptozy w hematopoezie może dostarczać informacji o mechanizmie odpowiedzialnym za regulację proliferacji komórek progenitorowych i macierzystych. Stwierdzono, że dysfunkcja apoptozy jest związana z białaczką. Opisano wzrost ekspresji markera apoptozy Apo-1/fas (CD 95) w mieloidalnych komórkach progenitorowych u pacjentów z CLL i odpowiadający mu spadek inhibitora apoptotycznego chłoniaka z komórek B 2 (BCL-2). Ostatnie badania wykazały również, że wzrost liczby limfocytów u pacjentów z CLL może być spowodowany zaburzoną równowagą między proliferacją a apoptozą komórek CLL, podczas gdy zmiany w ekspresji białek związanych z apoptozą są rozpoznawane podczas wszystkich etapów Bineta w CLL. Poziomy p38 są zmniejszone (odporność na apoptozę), a indukowane białko różnicowania komórek białaczki szpikowej (Mcl-1) i poziomy surwiwiny są podwyższone, tak aby zwiększyć przeżywalność limfocytów B.

Surwiwina jest białkowym inhibitorem apoptozy, który hamuje kaspazy i blokuje śmierć komórki. Jego wysoka ekspresja występuje w większości nowotworów, w tym hematologicznych, i wiąże się ze złymi wynikami klinicznymi. Marker apoptozy CD 95 (Apo-1/fas) i jego ligand CD 95 jest ligandem receptora śmierci, który pośredniczy w indukcji apoptozy w celu utrzymania homeostazy immunologicznej i ma zdolność pośredniczenia w indukcji apoptozy w komórkach nowotworowych, generując 18-kilodaltonowy fragment określany jako cytokeratyna-18 rozszczepiona kaspazą (cCK-18).

Wykazano, że oleocanthal indukuje cytotoksyczność i apoptozę in vitro w ostrej białaczce promielocytowej u ludzi iw komórkach szpiczaka. Może również powodować pierwotną martwicę i apoptozę komórkową poprzez indukowanie przepuszczalności błony lizosomalnej w różnych liniach komórek nowotworowych.

Celem tego badania, uwzględniającego silne właściwości apoptotyczne oleokantalu in vitro, było zbadanie jego zdolności, w rzeczywistych warunkach klinicznych, do wpływania na profil hematologiczny i biochemiczny; także komórkowe markery apoptozy Surwiwina, cCK18- (marker aktywności kaspazy) i Apo1fas/CD 95 u pacjentów z PBL po uwzględnieniu progresji ich choroby. Z tego powodu przeprowadzono badanie dotyczące interwencji dietetycznej, porównujące działanie przeciwnowotworowe EVOO bogatego w oleokantal u pacjentów z PBL.

Materiał i metody

W prezentowanym badaniu metodą ilościowej spektroskopii NMR (qNMR) przeprowadzono selekcję 300 próbek handlowych (wybranych z bazy danych >3000 próbek), uzyskanych z oliwek (Olea europaea L.) zebranych w sezonie 2017-2018 w celu zidentyfikowania olejów, które mogłyby spełniać następujące kryteria: Oliwa ekstra z pierwszego tłoczenia miałaby wysoką zawartość oleokantalu i oleacyny (indeks D1) oraz niską zawartość innych sprzężonych fenoli sekoirydoidów (3-8) lub nawet brak zawartości innych sekoirydoidów lub wolnego tyrozolu i hydroksytyrozolu W szczególności olej bogaty w Oleocanthal otrzymano z olejku jednoodmianowego odmiany Lianolia Kerkyras dostarczonego przez firmę „The Governor” z Agios Matthaios, Korfu, Grecja. Olej ten zawierał: oleokantal 416±7 mg/kg, oleacynę 284±10 mg/kg, tyrozol < 10 mg/kg, hydroksytyrozol < 10 mg/kg (D1 = 700 mg/kg). Należy wspomnieć, że poza analizą qNMR oznaczono również zawartość hydroksytyrozolu i tyrozolu standardową metodą IOC do oznaczania biofenoli oliwy z oliwek. Wyselekcjonowane EVOO bezpośrednio po ich analizie i do początku okresu badań przechowywano w temperaturze 4 st. C w celu zminimalizowania ewentualnych zmian składu chemicznego.

Pacjenci Dwudziestu jeden pacjentów z kliniki hematologicznej szpitala ogólnego w Lakonii (Grecja) zostało włączonych do udziału w interwencji dietetycznej. Rozpoznanie PBL potwierdzono standardowymi kryteriami. Pacjenci byli nieleczeni, w stadium Rai 0 do II.

Interwencja dietetyczna Na początku badania pilotażowego rejestrowano badania lekarskie historii każdego pacjenta przez trzeci i szósty miesiąc przed interwencją dietetyczną. Dokumentacja kliniczna przed interwencją dietetyczną dotyczy profilu hematologicznego, badań biochemicznych, w tym profilu lipidemicznego, glukozy na czczo, wskaźników czynności wątroby i nerek, a także danych dotyczących biopsji szpiku, markerów nowotworowych i immunofenotypu. Odnotowano również leczenie farmakologiczne lub choroby współistniejące.

Na początku pilotażowej interwencji dietetycznej grupa 21 pacjentów z PBL spożywała przed posiłkami 40 ml dziennie EVOO bogatego w olecantal i oleacynę (OC/OL) przez 6 miesięcy w celu zbadania wpływu spożycia diety A-EVOO na badanych markerach hematologicznych, biochemicznych i molekularnych. Ilość spożywanego EVOO OC/OL dobrano na podstawie wcześniejszego badania. (15) Pacjentom zalecono kontynuowanie regularnej diety; przestrzeganie przez nich protokołu badania było oceniane przez dwie całodobowe rozmowy telefoniczne co dwa tygodnie.

Próbki krwi obwodowej od 21 pacjentów z PBL pobrano na początku, po 3 miesiącach i po 6 miesiącach od rozpoczęcia interwencji dietetycznej. Wykonano morfologię krwi i pełne testy biochemiczne w kierunku glukozy na czczo, profilu lipidowego krwi oraz markerów czynności wątroby i nerek. Analizy surowicy przeprowadzono stosując tę ​​samą procedurę iw tym samym laboratorium z użyciem analizatora biochemicznego (Olympus AU-600, Olympus, Tokio, Japonia).

Dostępny w handlu test immunoenzymatyczny (ELISA) zastosowano zgodnie z instrukcjami dostawcy do oznaczenia markerów apoptozy M30 Apoptosense-cCK18 (VLVbio Hästholmsvägen, Szwecja), Apo-1/Fas/CD 95 (Novus Biologicals, Colorado USA ) i antyapoptotycznego markera Surwiwiny (OriGene Technologies, Inc USA) do próbek osocza wszystkich pacjentów we wszystkich badanych punktach czasowych.

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu SPSS v.24 (SPSS Inc., Chicago, IL. USA), a poziom istotności ustalono na 0,05. Wstępnie dokonano analizy opisowej próbki pod kątem wieku, płci, markerów klinicznych, biochemicznych i molekularnych. Stwierdzono, że markery były wypaczone na poziomie istotności p < 0,05, gdy sprawdzano je za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa. Dlatego zastosowano nieparametryczny test U Manna-Whitneya, aby znaleźć różnice między grupą interwencyjną a grupą kontrolną.

Różnice między przedziałami czasowymi interwencji oceniano testem nieparametrycznym Friedmana, a następnie testem porównań wielokrotnych Dunna. Ostatecznie korelacje markerów molekularnych z parametrami klinicznymi włączonymi do badania i sprawdzano za pomocą Spearmana Rho.