Intervento dietetico con EVOO ad alto contenuto fenolico in CLL

L'olio extra vergine di oliva (EVOO) è il componente principale della dieta mediterranea. Nell'olio d'oliva sono stati rilevati più di 200 diversi composti chimici, inclusi acidi grassi, steroli, carotenoidi, terpenoidi, flavonoidi, tocoferoli e polifenoli delle olive. L'olio di oliva vergine contiene una varietà di importanti componenti fenolici, principalmente corrispondenti ai composti tirosolo, idrossitirosolo, oleocantale (OC), oleacina (OL), ligstroside e oleuropeina agliconi. è stato isolato da EVOO, presenta una vasta gamma di effetti biologici tra cui attività antiossidanti, antinfiammatorie, antitumorali, neuroprotettive e antidiabetiche e per questo motivo ha attirato maggiore attenzione scientifica.

La leucemia linfocitica cronica (LLC), la leucemia adulta più comunemente diagnosticata nei paesi occidentali, è responsabile di circa 1 caso su 4 di tutte le leucemie. È caratterizzata dall'accumulo di cellule B monoclonali nel midollo osseo, nel sangue periferico, nei tessuti linfatici e nella milza, mentre è spesso asintomatica e lenta nel suo sviluppo. I pazienti con CLL non richiedono sempre una terapia immediata. Tuttavia, i pazienti che presentano sintomi hanno un range di sopravvivenza mediano approssimativo da 18 mesi a 6 anni a seconda dello stadio clinico. I criteri per la diagnosi di CLL sono linfociti B monoclonali ≥5000 linfociti/ml nel sangue periferico per almeno 3 mesi, prolinfociti ≤55%, co-espressione del claster di differenziazione (CD)5 e antigeni di superficie delle cellule B CD 19, CD 20 e CD 23, bassi livelli di CD 20, CD 79b e bassa espressione di immunoglobuline di superficie (sIg) e restrizione delle catene leggere kappa o lambda. Le procedure cliniche standard per stimare la prognosi sono i sistemi di stadiazione clinica sviluppati da Rai et al e Binet et al.

Il livello di apoptosi nell'emopoiesi può fornire informazioni sul meccanismo responsabile della regolazione della proliferazione delle cellule progenitrici e staminali. La disfunzione dell'apoptosi è risultata essere associata alla leucemia. È stato descritto un aumento dell'espressione del marcatore apoptotico Apo-1/fas (CD 95) nelle cellule progenitrici mieloidi nei pazienti affetti da CLL e una corrispondente diminuzione dell'inibitore del linfoma a cellule B apoptotico 2 (BCL-2). Recenti studi hanno anche dimostrato che l'aumento dei linfociti dei pazienti affetti da CLL può essere dovuto all'equilibrio disturbato tra la proliferazione e l'apoptosi delle cellule CLL mentre i cambiamenti nell'espressione proteica correlata all'apoptosi sono riconosciuti durante tutte le fasi di Binet nella CLL. I livelli di p38 sono ridotti (resistenza all'apoptosi) e i livelli di Induced myeloid leukemia cell differenziation protein (Mcl-1) e Survivin sono elevati, in modo da aumentare la sopravvivenza dei linfociti B.

Survivin è un inibitore proteico dell'apoptosi che inibisce le caspasi e blocca la morte cellulare. È altamente espresso nella maggior parte dei tumori, compresi quelli ematologici, ed è associato a uno scarso esito clinico. Il marcatore apoptotico CD 95 (Apo-1/fas) e il suo ligando, CD 95 è un ligando del recettore della morte che media l'induzione dell'apoptosi al fine di mantenere l'omeostasi immunitaria e ha la capacità di mediare l'induzione dell'apoptosi nelle cellule tumorali, generando un 18 kilodalton frammento chiamato citocheratina-18 scissa dalla caspasi (cCK-18).

È stato dimostrato che l'oleocantale induce citotossicità e apoptosi in vitro nella leucemia promielocitica acuta umana e nelle cellule di mieloma. Può anche causare necrosi primaria e apoptosi cellulare inducendo la permeabilità della membrana lisosomiale in diverse linee cellulari tumorali.

Lo scopo di questo studio, tenendo conto delle forti proprietà apoptotiche dell'oleocantale in vitro, era quello di indagare la sua capacità, in contesti clinici reali, di influenzare il profilo ematologico e biochimico; anche i marcatori di apoptosi cellulare Survivin, cCK18- (marcatore di attività della caspasi) e Apo1fas/CD 95 nei pazienti affetti da CLL dopo aver preso in considerazione la progressione della loro malattia. Per questo motivo è stato condotto uno studio sull'intervento dietetico confrontando gli effetti antineoplastici di un EVOO ricco di oleocantale nei pazienti affetti da CLL.

Materiale e metodi

Nel presente studio, è stato eseguito uno screening di 300 campioni commerciali (selezionati in un database di >3000 campioni), ottenuti da olive (Olea europaea L.) raccolte nella stagione 2017-2018, mediante il metodo della spettroscopia NMR quantitativa (qNMR) in al fine di identificare oli che potrebbero soddisfare i seguenti criteri: L'olio extravergine avrebbe un alto contenuto di oleocantale e oleacina (indice D1) e basso o addirittura nessun contenuto in altri fenoli coniugati secoiridoidi (3-8) o tirosolo libero e idrossitirosolo In particolare Olio ricco di L'oleocanthal è stato ottenuto dall'olio monovarietale della varietà Lianolia Kerkyras fornito dalla compagnia "The Governor" di Agios Matthaios, Corfù, Grecia. Questo olio conteneva: Oleocanthal 416±7 mg/Kg, oleacina 284±10 mg/Kg, Tirosolo < 10 mg/Kg, Idrossitirosolo < 10 mg/Kg (D1 = 700 mg/Kg). Va detto che oltre all'analisi qNMR, il contenuto di idrossitirosolo e tirosolo è stato misurato anche con il metodo IOC standard per la misurazione dei biofenoli dell'olio d'oliva. EVOO selezionato subito dopo la loro analisi e fino all'inizio del periodo di studio sono stati conservati a 4 gradi Celsius per ridurre al minimo possibili alterazioni nella composizione chimica.

Soggetti Ventuno pazienti della clinica ematologica dell'ospedale generale di Lakonia (Grecia) sono stati arruolati per partecipare all'intervento dietetico. La diagnosi di CLL è stata confermata da criteri standard. I pazienti non sono stati trattati, in Rai stadio 0 a II.

Intervento dietetico All'inizio dello studio pilota sono stati registrati gli esami medici della storia di ciascun paziente per il terzo e il sesto mese prima dell'intervento dietetico. La cartella clinica prima dell'intervento dietetico riguarda il profilo ematologico, gli esami biochimici compresi, il profilo lipidico, la glicemia a digiuno, i marcatori di funzionalità epatica e renale, nonché i dati relativi alla biopsia midollare, ai marcatori neoplastici e all'immunofenotipo. Sono stati registrati anche trattamenti farmacologici o comorbilità.

All'inizio dell'intervento dietetico pilota un gruppo di 21 pazienti con CLL ha consumato prima dei pasti 40 ml/die di EVOO ricco di olecantale e oleacina (OC/OL) per 6 mesi, al fine di esplorare l'effetto del consumo dietetico dell'A-EVOO sui marcatori ematologici, biochimici e molecolari studiati. La quantità di EVOO OC/OL consumato è stata scelta in base a uno studio precedente. (15) Ai pazienti è stato consigliato di continuare la loro dieta regolare; la loro aderenza al protocollo dello studio è stata valutata mediante due richiami telefonici 24 ore su 24 ogni due settimane.

I campioni di sangue periferico dei 21 pazienti con CLL sono stati raccolti all'inizio, dopo 3 mesi e dopo 6 mesi dall'inizio dell'intervento dietetico. Sono stati eseguiti emocromo intero e test biochimici completi per glicemia a digiuno, profilo lipidico nel sangue e marcatori di funzionalità epatica e renale. Le analisi del siero sono state condotte utilizzando la stessa procedura e presso lo stesso laboratorio con l'uso di un analizzatore biochimico (Olympus AU-600, Olympus, Tokyo, Giappone).

Un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) disponibile in commercio è stato utilizzato secondo le istruzioni del fornitore per analizzare i marcatori apoptotici M30 Apoptosense-cCK18 (VLVbio Hästholmsvägen, Svezia), Apo-1/Fas/CD 95 (Novus Biologicals, Colorado USA ) e il marcatore antiapoptotico Survivin (OriGene Technologies, Inc USA) in campioni di plasma di tutti i pazienti in tutti i punti temporali studiati.

L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando SPSS v.24 (SPSS Inc., Chicago, IL. USA) e il livello di significatività è stato fissato a 0,05. Inizialmente è stata eseguita un'analisi descrittiva del campione in termini di età, sesso, marcatori clinici, biochimici e molecolari. I marcatori sono risultati distorti a livello di significatività p <0,05 quando controllati utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov. Pertanto è stato utilizzato il test U di Mann-Whitney non parametrico per scoprire le differenze tra l'intervento e il gruppo di controllo.

Le differenze tra gli intervalli temporali dell'intervento sono state valutate con il test non parametrico di Friedman seguito dal test di Dunn per il confronto multiplo Infine, le correlazioni dei marcatori molecolari con i parametri clinici inclusi nello studio e sono state verificate con Spearman Rho.