Intervenção dietética com EVOO altamente fenólico na LLC

O azeite extra virgem (EVOO) é o principal componente da dieta mediterrânea. Mais de 200 compostos químicos diferentes foram detectados no azeite, incluindo ácidos graxos, esteróis, carotenóides, terpenóides, flavonóides, tocoferóis e polifenóis da azeitona. O azeite virgem contém uma variedade de componentes fenólicos importantes, correspondendo principalmente aos compostos tirosol, hidroxitirosol, oleocanthal (OC), oleacina (OL), agliconas de listrosídeo e oleuropeína. foi isolado do EVOO, apresenta uma ampla gama de efeitos biológicos, incluindo atividades antioxidantes, anti-inflamatórias, anticancerígenas, neuroprotetoras e antidiabéticas e, por esse motivo, atraiu mais atenção científica.

A Leucemia Linfocítica Crônica (LLC), a leucemia adulta mais comumente diagnosticada nos países ocidentais, é responsável por cerca de 1 em cada 4 casos de todas as leucemias. É caracterizada pelo acúmulo de células B monoclonais na medula óssea, sangue periférico, tecidos linfáticos e baço, sendo frequentemente assintomática e de desenvolvimento lento. Pacientes com LLC nem sempre requerem terapia imediata. No entanto, os pacientes que apresentam sintomas têm uma sobrevida mediana aproximada de 18 meses a 6 anos, dependendo do estágio clínico. Os critérios para o diagnóstico de LLC são linfócitos B monoclonais ≥5.000 linfócitos/ml no sangue periférico por pelo menos 3 meses, pró-linfócitos ≤55%, co-expressão de claster of diferenciation (CD)5 e antígenos de superfície de células B CD 19, CD 20 e CD 23, baixos níveis de CD 20, CD 79b e baixa expressão de imunoglobulinas de superfície (sIg) e restrição de cadeia leve kappa ou lambda. Os procedimentos clínicos padrão para estimar o prognóstico são os sistemas de estadiamento clínico desenvolvidos por Rai et al e Binet et al.

O nível de apoptose na hematopoiese pode fornecer informações sobre o mecanismo responsável pela regulação da proliferação de progenitoras e células-tronco. Descobriu-se que a disfunção da apoptose está associada à leucemia. Foi descrito um aumento na expressão do marcador apoptótico Apo-1/fas (CD 95) em células progenitoras mieloides em pacientes com LLC e uma diminuição correspondente no inibidor do linfoma 2 de células B apoptóticas (BCL-2). Estudos recentes mostraram também que o aumento de linfócitos em pacientes com LLC pode ser devido ao equilíbrio perturbado entre a proliferação e a apoptose das células da LLC, enquanto as alterações na expressão de proteínas relacionadas à apoptose são reconhecidas durante todos os estágios de Binet na LLC. Os níveis de p38 estão reduzidos (resistência à apoptose) e a proteína de diferenciação celular da leucemia mielóide induzida (Mcl-1) e os níveis de Survivina estão elevados, de modo a aumentar a sobrevida dos linfócitos B.

A survivina é uma proteína inibidora da apoptose que inibe as caspases e bloqueia a morte celular. É altamente expresso na maioria dos cânceres, inclusive hematológicos, e está associado a um mau prognóstico clínico. O marcador apoptótico CD 95 (Apo-1/fas) e seu ligante, CD 95 é um ligante do receptor de morte que medeia a indução da apoptose para manter a homeostase imune e tem a capacidade de mediar a indução da apoptose em células cancerígenas, gerando um fragmento denominado citoqueratina-18 clivada por caspase (cCK-18).

Demonstrou-se que o oleocanthal induz citotoxicidade e apoptose in vitro em leucemia promielocítica aguda humana e em células de mieloma. Também pode causar necrose primária e apoptose celular por induzir a permeabilidade da membrana lisossômica em diferentes linhagens de células cancerígenas.

O objetivo deste estudo, levando em consideração as fortes propriedades apoptóticas do oleocanthal in vitro, foi investigar sua capacidade, em condições clínicas reais, de afetar o perfil hematológico e bioquímico; também os marcadores apoptóticos celulares Survivin, cCK18- (marcador de atividade de caspase) e Apo1fas/CD 95 em pacientes com LLC após levar em consideração a progressão de sua doença. Por esse motivo, foi realizado um estudo de intervenção dietética comparando os efeitos antineoplásicos de um EVOO rico em oleocanthal em pacientes com LLC.

Material e métodos

No presente estudo, uma triagem de 300 amostras comerciais (selecionadas em um banco de dados de mais de 3.000 amostras), obtidas de azeitonas (Olea europaea L.) colhidas na safra 2017-2018, foi realizada pelo método de espectroscopia Quantitativa de RMN (qNMR) em para identificar os óleos que poderiam atender aos seguintes critérios: O óleo extravirgem teria alto teor de oleocanthal e oleacina (índice D1) e baixo ou mesmo nenhum teor de outros fenólicos conjugados secoiridóides (3-8) ou tirosol livre e hidroxitirosol Especificamente Óleo rico em Oleocanthal foi obtido do óleo Monovarietal da variedade Lianolia Kerkyras fornecido pela "The Governor" Company de Agios Matthaios, Corfu, Grécia. Este óleo continha: Oleocanthal 416±7 mg/Kg, oleacina 284±10 mg/Kg, Tirosol < 10 mg/Kg, Hidroxitirosol < 10 mg/Kg (D1 = 700 mg/Kg). Deve-se mencionar que, além da análise de qNMR, o teor de hidroxitirosol e tirosol também foi medido pelo método IOC padrão para medição de biofenóis do azeite. Os EVOOs selecionados imediatamente após sua análise e até o início do período de estudo foram armazenados a 4 graus Celsius para minimizar possíveis alterações na composição química.

Sujeitos Vinte e um pacientes da clínica hematológica do Hospital Geral de Lakonia (Grécia), foram inscritos para participar da intervenção dietética. O diagnóstico de LLC foi confirmado por critérios padrão. Os pacientes não foram tratados, em Rai estágio 0 a II.

Intervenção dietética No início do estudo piloto, os exames médicos da história de cada paciente foram registrados para o terceiro e sexto mês antes da intervenção dietética. A ficha clínica antes da intervenção dietética diz respeito ao perfil hematológico, exames bioquímicos incluindo, perfil lipidêmico, glicemia de jejum, marcadores de função hepática e renal, bem como dados referentes à biópsia de medula sanguínea, marcadores neoplásicos e imunofenótipo. Tratamento medicamentoso ou comorbidades também foram registrados.

No início da intervenção dietética piloto, um grupo de 21 pacientes com LLC consumiu antes das refeições 40 ml/dia de EVOO rico em olecanthal e oleacina (OC/OL) por 6 meses, a fim de explorar o efeito do consumo dietético do A-EVOO sobre os marcadores hematológicos, bioquímicos e moleculares estudados. A quantidade de EVOO OC/OL consumida foi escolhida de acordo com um estudo anterior. (15) Os pacientes foram orientados a manter sua dieta regular; sua adesão ao protocolo do estudo foi avaliada por dois telefonemas de 24 horas a cada duas semanas.

Amostras de sangue periférico dos 21 pacientes com LLC foram coletadas no início, após 3 meses e após 6 meses do início da intervenção dietética. Hemograma total e testes bioquímicos completos foram realizados para glicemia de jejum, perfil lipídico no sangue e marcadores de função hepática e renal. As análises de soro foram realizadas usando o mesmo procedimento e no mesmo laboratório com o uso de um analisador bioquímico (Olympus AU-600, Olympus, Tóquio, Japão).

Um ensaio imunoenzimático disponível comercialmente (ELISA) foi usado de acordo com as instruções do fornecedor para testar os marcadores apoptóticos M30 Apoptosense-cCK18 (VLVbio Hästholmsvägen, Suécia), Apo-1/Fas/CD 95 (Novus Biologicals, Colorado EUA ) e o marcador antiapoptótico Survivin (OriGene Technologies, Inc USA) em amostras de plasma de todos os pacientes em todos os momentos estudados.

A análise estatística foi realizada usando SPSS v.24 (SPSS Inc., Chicago, IL. EUA) e o nível de significância foi fixado em 0,05. Inicialmente foi realizada uma análise descritiva da amostra quanto à idade, sexo, marcadores clínicos, bioquímicos e moleculares. Os marcadores mostraram-se assimétricos em nível de significância p < 0,05 quando verificados pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Portanto, o teste não paramétrico U de Mann-Whitney foi usado para descobrir as diferenças entre o grupo de intervenção e o grupo de controle.

As diferenças entre os intervalos de tempo da intervenção foram avaliadas com o teste não paramétrico de Friedman seguido do teste de Dunn para comparação múltipla. Finalmente, as correlações dos marcadores moleculares com os parâmetros clínicos incluídos no estudo foram verificadas com Spearman Rho.