Ocena skuteczności zabiegu przeszczepu keratynocytów melanocytów w leczeniu bielactwa

W pierwszym ramieniu badania normalnie pigmentowany obszar na ciele pacjenta znieczulano 1% lidokainą z epinefryną. Za pomocą noża chirurgicznego badacz usunął niewielką część naskórka, który nie jest dotknięty bielactwem, z małego obszaru (2 cm2) na udzie pacjenta, aby uzyskać komórki dawcy. Naskórek zebrany nożem chirurgicznym przemyto trzykrotnie roztworem Ringera z dodatkiem mleczanu, a następnie dysocjowano trypsyną w celu rozdzielenia komórek na zawiesinę pojedynczych komórek. Obszar biorcy, który miał być wszczepiony, został poddany ablacji laserem Erbium YAG (granat itrowo-glinowy). Połowa zdysocjowanych pojedynczych komórek z obszaru dawcy (uda) została następnie przeszczepiona na obszar dotknięty bielactwem, który uczestnik jest zainteresowany przeszczepem (powierzchnia 5 cm2).

Badacz następnie ocenił odpowiedź na leczenie w przeszczepionych obszarach po 1 dniu, 1 tygodniu, 1 miesiącu i 3 miesiącach oraz 6 miesiącach, zarówno fotografując, jak i określając ilościowo wynik VASI (Vitiligo Area Scoring Index).

VASI (Vitiligo Area Scoring Index) to procent zaangażowania bielactwa nabytego i jest obliczany w kategoriach jednostek ręcznych. Jedna jednostka dłoni odpowiada w przybliżeniu 1% całkowitej powierzchni ciała.

W drugim ramieniu badania badacz zastosował minimalnie inwazyjną procedurę (przeszczep pęcherzowy z odsysaniem) w celu pobrania próbki przeszczepionej skóry i skóry dawcy – ta metoda może oddzielić naskórek od skóry właściwej bez wywoływania blizny. Normalnie pigmentowany obszar na górnej części uda znieczulono 1% lidokainą z epinefryną. Stosując technikę odsysania pęcherzyków, badacz usunął niewielką część naskórka, który nie był dotknięty bielactwem, z małego obszaru (4 cm2 lub 0,6 cala cm2) na udzie pacjenta, aby uzyskać komórki dawcy. Zebrany naskórek przemyto trzykrotnie roztworem Ringera z dodatkiem mleczanu, a następnie dysocjowano przy użyciu trypsyny w celu rozdzielenia komórek na zawiesinę pojedynczych komórek. Obszary biorcze przeznaczone do przeszczepu wykorzystano do pobrania naskórka za pomocą blistrowego urządzenia do odsysania. Połowę zdysocjowanych pojedynczych komórek z obszaru dawcy (uda) następnie przeszczepiono na obszar dotknięty bielactwem, który pacjent był zainteresowany przeszczepem (powierzchnia 5 cm2 lub 0,7 cala2). Odsysaną skórę pęcherzy z miejsc biorczych dysocjowano jednocześnie do zawiesiny pojedynczych komórek. Część pozostałych komórek (zarówno z miejsca dawcy, jak i biorcy) poddano sortowaniu przepływowemu w celu ilościowego określenia populacji melanocytów i keratynocytów oraz szczegółowej analizie molekularnej (sekwencjonowanie i histologia pojedynczych komórek RNA) w celu scharakteryzowania cech molekularnych przewlekłe bielactwo. Badacz następnie ocenił odpowiedź na leczenie w przeszczepionych obszarach po 1 dniu, 1 tygodniu, 1 miesiącu i 3 miesiącach oraz 6 miesiącach, zarówno fotografując, jak i oceniając ilościowo wynik VASI. Ta część badania jest zakończona.

W trzecim ramieniu badania badacz stosuje minimalnie inwazyjną procedurę (przeszczep pęcherzowy bez dysocjacji komórek) w celu pobrania próbki przeszczepionej skóry i skóry dawcy – ta metoda może oddzielić naskórek od skóry właściwej bez wywoływania blizny. Normalnie pigmentowany obszar na górnej części uda zostanie znieczulony 1% lidokainą z epinefryną. Za pomocą systemu pobierania naskórka, który jest techniką odsysania pęcherzy, badacz usunie wiele małych fragmentów (około 128 pęcherzy o średnicy 1,8 mm) naskórka nietkniętego bielactwem z małego normalnego obszaru (5 cm2) na udzie pacjenta w celu uzyskania komórek dawcy i przy użyciu zwykłego instrumentu podciśnieniowego do pobrania czterech próbek do badań histopatologicznych (dwóch z obszaru bielactwa i dwóch ze skóry normalnego dawcy). Naskórek z obszaru dawczego (uda) zostanie następnie przeszczepiony na obszar dotknięty bielactwem, który pacjent jest zainteresowany przeszczepem. Ponadto do oceny histopatologicznej przesłane zostaną cztery wycinki ze skóry normalnej i miejsca biorczego.

Następnie badacz oceni odpowiedź na leczenie w przeszczepionych obszarach po 1 dniu, 1 tygodniu, 1 miesiącu i 3 miesiącach oraz 6 miesiącach zarówno na podstawie fotografii, określając ilościowo zmianę powierzchni odbarwionej, jak i wynik VASI (Vitiligo Area Scoring Index) . Badacz oceni również dwie próbki bielactwa i dwie próbki normalnej skóry za pomocą histopatologii, aby ocenić, gdzie zlokalizowane są unikalne populacje komórek zidentyfikowane w ich analizie sekwencjonowania RNA (uzyskane z ramienia 2). Badacz stawia hipotezę, że jego procedura przeszczepu zapewni doskonałą lub dobrą repigmentację, skutkując średnio 60% redukcją pola powierzchni (SD=30%) od wartości wyjściowej do 6-miesięcznej obserwacji. Przy wielkości próby 5 pacjentów, to badanie osiągnie 90% mocy, aby przetestować tę hipotezę w oparciu o dwustronny sparowany test t na poziomie istotności p=0,05. Ponadto badacz porówna wyniki uzyskane od 7 pacjentów pobranych przy użyciu techniki ostrza chirurgicznego (zabieg już zakończony i oczekujące wyniki obserwacji) z wynikami uzyskanymi od 7 pacjentów pobranych za pomocą pęcherzy do odsysania (zakończone) i siedmiu pacjentów z nowo zaproponowanego grupa eksperymentalna (trzy ukończone do tej pory).