Wpływ palenia na zapalenie tkanek wokół implantu

Badanie przekrojowe zostanie przeprowadzone we współpracy z Zakładami Periodontologii na Wydziale Stomatologii Uniwersytetu w Bernie w Szwajcarii, Uniwersytetem Hatay Mustafa Kemal, Uniwersytetem Dokuz Eylul, Uniwersytetem Gazi i Uniwersytetem Ege w Turcji. Pierwszy etap badania zostanie przeprowadzony w Turcji, a drugi w Szwajcarii. Ponieważ Hatay jest jedną z trzech prowincji najbardziej dotkniętych trzęsieniem ziemi w Turcji w 2023 r., a szkoła dentystyczna Uniwersytetu Hatay Mustafa Kemal została poważnie zniszczona, pobranie próbek od pacjentów w Hatay jest niemożliwe. Dlatego projekt ten zaplanowano jako wieloośrodkowy, a próbki pacjentów będą pobierane z Dokuz Eylül, Uniwersytetu Gazi i Uniwersytetu Ege, Katedry Periodontologii, Wydziału Stomatologii. Próbki zostaną poddane analizie w Laboratorium Mikrobiologii Jamy Ustnej Wydziału Periodontologii Uniwersytetu w Bernie w Szwajcarii. Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyki ds. Wykorzystywania Ludzi w Badaniach Uniwersytetu Dokuz Eylul (Protokół nr: 2023/GOA-8246).

Badanie to obejmie 96 pacjentów, równo podzielonych na cztery grupy:

• Palacze z periimplantitis
• Osoby niepalące z zapaleniem periimplantitis
• Palacze ze zdrowymi tkankami wokół implantu
• Osoby niepalące ze zdrowymi tkankami wokół implantu

Stan palenia zostanie podzielony na dwie grupy: palący i niepalący (nigdy niepalący). Do grupy osób niepalących będą należeć byli palacze, którzy rzucili palenie co najmniej 6 lat temu.

Obliczone zostaną liczba wypalanych dziennie papierosów, wskaźnik palenia (średnia liczba papierosów dziennie x lata palenia tytoniu) i kieszonkowy rok palenia (średnia liczba papierosów dziennie x lata palenia tytoniu / liczba papierosów w kieszeń). Stan palenia zostanie wykryty na podstawie raportu własnego. Stan palenia zostanie później potwierdzony na podstawie poziomu kotyniny w ślinie. Stężenie kotyniny w ślinie przy paleniu będzie akceptowane na poziomie 5-7 ng/ml. Nasilenie palenia będzie określane na podstawie wyższych stężeń.

Parametry przyzębia Kliniczne pomiary przyzębia będą oceniane w oparciu o poniższe kryteria diagnostyki przyzębia. Pomiary będą wykonywane przy użyciu sondy periodontologicznej Williams (Hu-Friedy, Chicago, IL, USA) i obejmują głębokość kieszonki sondującej (PPD), kliniczny poziom przyczepu (CAL), wskaźnik płytki nazębnej (PI) 26, wskaźnik dziąseł (GI) 27, oraz procent krwawienia podczas sondowania (BOP) 28 w sześciu miejscach na ząb (mezjalno-policzkowa, policzkowa, dystalno-policzkowa, mezjalno-językowa, językowa i dystalno-językowa) każdego zęba.

Rozpoznanie chorób i schorzeń przyzębia będzie przeprowadzane na podstawie radiograficznych i klinicznych kryteriów diagnostycznych zaproponowanych przez Światowe Warsztaty na temat Klasyfikacji Chorób i Stanów Przyzębia i Wokół Implantów w 2017 r.29 Zdrowie wokół implantu będzie oceniane na podstawie braku wizualnych oznak choroby zapalenie, krwawienie podczas sondowania i dalsza utrata kości po początkowym zagojeniu, która nie powinna przekraczać ≥2 mm. Kryteriami dla pacjentów z zapaleniem periimplantitis będzie PPD ≥ 6 mm w połączeniu z obfitym krwawieniem i utratą kości ≥ 3 mm.

Dane demograficzne pacjentów i kliniczne badanie przyzębia/okolicy implantu

Zbierane będą następujące zmienne:

• Płeć
• Wiek
• BMI
• Wiek implantu
• Liczba i lokalizacja implantów
• Etapy fazy chirurgicznej
• Powikłania związane z leczeniem implantologicznym
• Nieprawidłowe położenie implantu
• Mobilność implantu i dyskomfort (różnice w wartościach Periotestu – PTV)
• Czas od obciążenia implantów do bieżącego badania (czas funkcjonowania)
• Projekt regeneracyjny
• Utrzymanie protezy
• Radiograficzny poziom kości
• Rodzaj i wielkość ubytku kostnego
• Obecność zrogowaciałej błony śluzowej
• Częstotliwość szczotkowania zębów
• Nitkowanie/szczotkowanie przestrzeni międzyzębowych
• Częstotliwość wizyt u dentysty
• Historia zapalenia przyzębia
• Przyczyna utraty zębów
• Używanie alkoholu

Kolekcja śliny

Od pacjentów pobierane będą próbki śliny jako niestymulowane. Próbki zostaną pobrane w ciągu 10 minut, kiedy uczestnicy zajmą miejsca siedzące. Próbki będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu przeniesienia do Katedry Periodontologii Szkoły Medycyny Stomatologicznej Uniwersytetu w Bernie, w suchym lodzie do analiz.

Zbieranie próbek płytki nazębnej

Próbki płytki nazębnej zostaną pobrane z obszaru periimplantitis i zapalenia przyzębia poddziąsłowego w grupie periimplantitis oraz obszaru poddziąsłowego zdrowego przyzębia i zdrowia wokół implantu w grupach zdrowia okołoimplantowego. Próbki implantów poddziąsłowych i płytki nazębnej będą pobierane z dwóch najgłębszych kieszonek przyzębnych i kieszonek wokół implantu w obrębie 200 µl RNAlater w probówkach Eppendorfa. Miejsca pobierania próbek zostaną odizolowane od śliny i lekko wysuszone na powietrzu. Próbka zostanie pobrana przy użyciu sterylnej łyżeczki Gracey (HuFriedy, Rotterdam, Holandia). Próbki zostaną pobrane z obszaru zdrowia wokół implantu tą samą metodą w grupie zdrowia wokół implantu. Probówki do mikrowirówki Eppendorf będą przechowywane w temperaturze -80°C do czasu przeniesienia do Instytutu Stomatologii Uniwersytetu w Bernie, w suchym lodzie w celu przeprowadzenia analiz.

Pobieranie próbek płynu dziąsłowego (GCF) i płynu dziąsłowego wokół implantu (PISF)

Próbki zostaną pobrane z dwóch najgłębszych kieszonek wokół implantu i dwóch najgłębszych kieszonek przyzębnych od pacjentów z zapaleniem tkanek wokół implantu. Zanieczyszczenia śliną można uniknąć, izolując każdy obszar za pomocą wacików i lekko odwadniając powietrzem. Płytka zostanie delikatnie usunięta za pomocą łyżeczki periodontologicznej. Stosując metodę kryzy, w ciągu 30 sekund zostanie pobranych 39 próbek za pomocą standardowych pasków papieru (Periopaper; Oraflow Inc., Plainview, NY). Objętości będą mierzone za pomocą wstępnie skalibrowanego elektronicznego urządzenia do pomiaru płynu dziąsłowego (Oraflow Inc., Plainview, NY). 40 Odczyty z urządzenia elektronicznego zostaną przeliczone na rzeczywistą objętość (μl) poprzez odniesienie do krzywej standardowej. Próbki zanieczyszczone krwią lub śliną zostaną wykluczone. Wszystkie sześć pasków Periopaper zostanie zebranych w plastikowych probówkach do mikrowirówki Eppendorf i przechowywanych w temperaturze -80°C do czasu przeniesienia do Instytutu Stomatologii Uniwersytetu w Bernie, w suchym lodzie do analiz.

Analizy laboratoryjne

Próbki śliny i płytki nazębnej zostaną przekazane do Laboratorium Mikrobiologii Jamy Jamy Ustnej, Wydziału Periodontologii, Szkoły Medycyny Stomatologicznej, Uniwersytetu w Bernie, a wszystkie analizy laboratoryjne zostaną wykonane przez dr Aysegula Sari w Laboratorium Mikrobiologii Jamy Jamy Ustnej, Wydziału Periodontologii, Szkoły stomatologii, Uniwersytet w Bernie, Szwajcaria, po podpisaniu umowy o transferze materiału.

Analiza biochemiczna

Stan palenia pacjentów zostanie określony na podstawie analizy kotyniny przy użyciu zestawu do testów immunoenzymatycznych w próbkach śliny.

Analiza mikrobiologiczna

Obecność i liczebność Fusobacterium jąkleatum, Campylobacter rectus, Prevotella intermedia, Aggregatinacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Saccharibacteria (TM7), Streptococcus aureus i Actinomyces oris zostaną przeanalizowane w próbkach płytki nazębnej. Ukierunkowana identyfikacja tych bakterii zostanie przeprowadzona metodą Real Time Q-PCR. Sekwencjonowanie 16sRNA zostanie wykorzystane do bezstronnej i nieukierunkowanej analizy mikrobiologicznej. Ekstrahowany zostanie całkowity genomowy DNA, a następnie zostanie przeprowadzona amplifikacja 16S rRNA.

Analiza GCF

Analiza GCF planowana jest jako drugie badanie. Do analizy próbek GCF i śliny zostanie wykorzystany multipleksowy test immunologiczny Luminex oparty na kulkach. Markery GCF i śliny zostały szeroko wybrane zgodnie z wcześniejszą literaturą jako markery stresu oksydacyjnego 8-OHdG, PARK7/DJ-1 i markery stanu zapalnego oksydazy NADPH IL-1beta, IL-17A/E, osteoprotegeryna (OPG); markery degradacji tkanki łącznej MMP-8, MMP-3; markery naprawy/regeneracji białko morfogeniczne kości (BMP)-2, naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF).

Analiza statystyczna

Ponieważ w literaturze nie ma podobnych badań, obliczenia próby przeprowadzono na podstawie wielkości efektu. Niezbędna wielkość próby wynosiła 24 dla każdej grupy, aby wykryć znaczącą różnicę przy wielkości efektu (dużej wielkości efektu) wynoszącej 0,4 i poziomie mocy 90% przy poziomie ufności 95% między czterema grupami. Do obliczeń wielkości próby wykorzystano pakiet Gpower w wersji 3.1. Normalność zmiennych ciągłych będzie oceniana za pomocą testu Shapiro-Wilka. Dla wartości o rozkładzie skośnym zostaną zastosowane nieparametryczne metody statystyczne. Test Kruskala-Wallisa zostanie przeprowadzony w celu porównania więcej niż dwóch zmiennych o rozkładzie normalnym, a test porównań wielokrotnych Dunna dla analiz wielokrotnych porównań parami post hoc. W celu porównania więcej niż dwóch grup o rozkładzie normalnym zostanie przeprowadzony jednokierunkowy test ANOVA, a dla wielokrotnych analiz porównawczych post hoc parami zostanie przeprowadzony test Tukeya. Zostaną wykonane ogólne modele liniowe w celu określenia wpływu nasilenia palenia na choroby wokół implantów i przyzębia.