Resposta robusta de anticorpos e citocinas à vacina contra hepatite B entre pacientes fora do tratamento com hepatite C crônica: um estudo de controle aberto na China

Desenho do estudo e participantes O estudo foi realizado em três condados (Yucheng, Xintai e Dongchangfu) da província de Shandong, China, que tiveram o maior número de casos de HCV relatados na província. Pacientes potenciais com infecção crônica pelo HCV foram recrutados verificando os registros médicos dos hospitais ou perguntando aos médicos da aldeia. Indivíduos saudáveis ​​foram selecionados aleatoriamente por 3 a 5 vezes de pacientes potenciais com infecção pelo HCV no mesmo município. A investigação do questionário foi feita e as amostras de sangue foram coletadas para cada paciente potencial e indivíduo saudável da mesma maneira.

Pesquisa por questionário Realizamos uma pesquisa baseada em questionário para coletar as informações básicas dos participantes, incluindo informações demográficas (idade, sexo, altura e peso), histórico médico (alergia, diagnóstico e tratamento da hepatite C crônica, vacinação, febre e outras doenças agudas) e estado comportamental (tabagismo, etilismo, gravidez e lactação).

Vacinação contra hepatite B e acompanhamento Três doses de vacina contra hepatite B produzidas por técnicas de DNA recombinante em Saccharomyces Cerevisiae (20 μg HBsAg/1,0ml por dose, Shenzhen Kangtai Biological Products Co., Ltd., Shenzhen, Província de Guangdong, China) foram administradas por via intramuscular na região deltóide a todos os participantes aos 0, 1 e 6 meses, respectivamente. Amostras de sangue dos participantes foram coletadas um mês após a primeira e a terceira dose de vacinação.

Ensaios laboratoriais e exame físico Teste de triagem e exame físico HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe, anti-HBc, anti-HCV e HCV RNA foram testados para todos os indivíduos nas visitas de inclusão; bilirrubina sérica, albumina sérica, tempo de protrombina, ALT plasmática e aspartato aminotransferase (AST) foram detectados no grupo HCV. HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe e anti-HBc foram analisados ​​por Abbott Chemiluminesent Microparticle ImmunoAssay (CMIA) (Abbott Ireland Diagnostics Division, Sligo, Irlanda). O anti-HCV foi medido por ELISA com um kit comercial (Intec products, INC, Xiamen, China). O RNA do HCV foi medido por PCR Quantitativo em Tempo Real com kits disponíveis comercialmente (QIAGEN, Shenzhen, China). A bilirrubina sérica, albumina, tempo de protrombina, plasma ALT e AST foram medidos usando reagentes e métodos padrão. Para avaliar a atividade da doença, cada paciente com infecção por HCV recebeu exame clínico, incluindo interrogatório, exame físico e ultrassonografia.

Ensaio de anti-HBs após vacinação O anti-HBs foi detectado usando CMIA (Abbott Ireland Diagnostics Division, Sligo, Irlanda) um mês após a primeira e a terceira dose de vacinação. Embora sem marcadores sorológicos de HBV, os indivíduos foram definidos como tendo uma história de infecção por HBV ou vacinação contra hepatite B se anti-HBs ≥100 mIU/ml um mês após a primeira dose de vacinação.

Ensaio CMI Antes da primeira dose de vacinação e um mês após a terceira dose de vacinação, 43 indivíduos do grupo HCV e 37 indivíduos do grupo controle saudável foram selecionados aleatoriamente para isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e testar a função CMI, respectivamente, incluindo interferon -γ (IFN-γ), interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5) e interleucina-6 (IL-6). Polipéptido S28-39, polipéptido MHC de classe I, polipéptido MHC de classe II e HBsAg foram utilizados como estimulante imunológico celular de IFN-y, respectivamente. O antígeno de superfície do vírus da hepatite B foi utilizado como estimulante imunológico celular de IL-2, IL-4, IL-5 e IL-6. Polipeptídeo S28-39, misturas de polipeptídeos MHC classe I e misturas de polipeptídeos MHC classe II foram sintetizados em BO MAI JIE Technology Co. LTD. (Pequim, China). O HBsAg foi fornecido pela Shenzhen Kangtai Biological Products Co., Ltd. (Shenzhen, China).

As PBMCs separadas do sangue anticoagulado com EDTA foram ajustadas para a concentração de 2 × 106 células/mL. 100 μL 2 × 106 células /mL PBMCs foram adicionados nas placas pré-revestidas de PVDF de 96 poços e 100 μL de peptídeo HBsAg S28-39 (IPQSLDSWWTSL, concentração final: 10 μg/mL), 100 μL de misturas de polipeptídeos MHC classe I, 100 μL da mistura polipeptídica MHC de classe II ou 100 μL de HBsAg (80μg/mL) em cada poço. Quando se tratava de IL-2, IL-4, IL-5 e IL-6, as placas foram inundadas com 100 μL 2 × 106 células/mL PBMC e 100 μL HBsAg (80μg/mL) em cada poço. Em seguida, foram incubados a 37 °C, em incubadora 5% CO2 e umidificada por 20 h (IFN-γ, IL-2) ou 40 h (IL-4, IL-5 e IL-6). Após a incubação, as placas foram manipuladas de acordo com o manual de instruções do R&D ELISPOT Kit (R&D Systems, Inc.). As células formadoras de manchas (SFCs) foram enumeradas com o sistema ImmunoSpotTM (Cellular Technology Ltd.).

Avaliação da segurança Os participantes receberam cartões diários para registrar a ocorrência e gravidade das reações locais solicitadas no local da injeção (dor, endurecimento, eritema, edema, prurido) durante 7 dias após a vacinação, reações sistêmicas solicitadas (febre, dor de cabeça, fadiga, tosse , mialgia, astenia, vertigem, diarreia) e qualquer adverso não solicitado durante 29 dias após a vacinação.

Análises estatísticas A entrada de dados e o gerenciamento do banco de dados foram realizados por EPIDATA 3.0 e Microsoft Excel 2010, respectivamente. A análise dos dados foi realizada pelo Stata 11.0. As diferenças entre o grupo HCV e o grupo de controle saudável em variáveis ​​contínuas e categóricas foram examinadas por meio de regressão logística condicionada. Subgrupos de respondedores baixos e não respondedores versus respondedores normais e altos foram avaliados em relação às características demográficas, indicadores bioquímicos, status de doença hepática e HCV RNA. Um teste t de Student ou ANOVA de uma via foram usados ​​para comparar o título médio de anti-HBs entre diferentes subgrupos. O teste exato de Fisher foi usado para comparar as taxas de resposta. O teste não paramétrico foi usado para comparar manchas de imunodotting. A análise de correlação de classificação de Sperman foi usada para avaliar a correlação entre pontos de imunodotting e anti-HBs. Para todas essas comparações, um P<0,05 bilateral é considerado estatisticamente significativo.