Heterogeneidade de Células Dendríticas em Câncer de Cólon e Pulmão de Células Não Pequenas (TUM-DC)

ANTECEDENTES A ativação de respostas imunes adaptativas depende de células dendríticas (DCs) e macrófagos, células mieloides do sistema imune inato especializadas na apresentação de antígenos e na ativação de células T. Essa peculiaridade das células mielóides é fundamental não apenas durante doenças infecciosas, mas também no contexto do câncer, pois os fagócitos captam antígenos associados às células cancerígenas e os apresentam às células T dentro do microambiente tumoral ou nos linfonodos de drenagem tumoral para obter respostas antitumorais .

Em particular, foi observada uma correlação positiva entre o conteúdo tumoral geral de DC e a sobrevida de pacientes com câncer com diferentes tumores, bem como uma melhor reatividade a terapias baseadas no uso de inibidores de imunocheckpoint (ICB).

A presença de diferentes subtipos de células dendríticas foi recentemente revelada, bem como uma adaptação específica de cada subtipo ao ambiente tumoral.

Este é um ponto crítico, uma vez que a heterogeneidade funcional de DCs, macrófagos e células T no microambiente tumoral é provavelmente um dos fatores responsáveis ​​pelo sucesso ou fracasso das imunoterapias anticancerígenas. As terapias baseadas em ICB revolucionaram o tratamento de pacientes com câncer, como melanoma e câncer de pulmão, mas atualmente são benéficas apenas para uma minoria de pacientes. Melhorar a compreensão do microambiente imunológico do tumor é a chave para prever as respostas clínicas às terapias existentes e possivelmente o desenvolvimento de novas imunoterapias.

FUNDAMENTOS Células mieloides, como células dendríticas e macrófagos, infiltram-se em muitos tipos diferentes de tumores e podem exercer uma função antitumoral ativando células T e NK, ou podem realizar uma atividade pró-tumoral produzindo citocinas anti-inflamatórias e moléculas inibidoras. A presença dentro do tumor de vários subtipos convencionais de DC tem sido associada a um melhor prognóstico, enquanto uma função pró-tumoral tem sido proposta para DC não convencionais, como CD14 + CD1c + DC. A presença de macrófagos tem sido associada a uma ação pró-tumoral.

Os investigadores levantam a hipótese de que a heterogeneidade funcional das células mieloides e das células T dentro do microambiente tumoral é um dos fatores responsáveis ​​pelo sucesso ou fracasso das respostas imunes antitumorais. A definição de alta resolução de subtipos de células mielóides e células T associadas ao tumor, seu fenótipo, distribuição dentro do tumor, bem como suas características funcionais, ajudará a entender a complexidade do microambiente do tumor.

DESENHO DO ESTUDO Após a coleta, cada amostra será identificada e rotulada com um ID exclusivo. O patologista coletará o material e selecionará o tecido que pode ser usado para o experimento depois de coletar tudo o que é necessário para fins de diagnóstico. A amostra da pesquisa será colocada em tubos de ensaio e mantida em gelo. Em seguida, será enviado ao laboratório da Universidade de Milano-Bicocca. O tumor será cortado em pedaços e suspensões de células individuais serão preparadas com o kit de dissociação de tumor humano e o dissociador gentleMACS™ (Miltenyi Biotech) de acordo com o protocolo padrão. As suspensões de células serão então isoladas por centrifugação em gradiente de densidade.

Os investigadores irão analisar aproximadamente 60 pacientes para estudos de imunofluorescência e 4 pacientes para análises transcriptômicas de células únicas (single cell RNA-seq). A análise de célula única realizada por 4 pacientes já se mostrou suficiente para identificar diferentes subtipos de células imunes. Células imunes serão tratadas para obtenção de uma suspensão celular enriquecida em células mieloides. Isso permitirá uma análise precisa dos subtipos de DC, macrófagos e células T CD4 + e identificar até mesmo populações muito raras que podem ser perdidas em amostras não selecionadas devido à diluição. A estratégia de pré-triagem será baseada na expressão de CD45 e MHC classe II e na ausência de expressão de CD3, CD19, CD56, Ly6G para excluir T, B, NK e neutrófilos.

O material residual não será armazenado. Presume-se que os pacientes serão inscritos e analisados ​​ao longo de um período de 5 anos.

Existem 5 tarefas diferentes:

Tarefa1: Preparação e sequenciação da biblioteca de sequências de ARN de célula única; Tarefa 2: Análise bioinformática de RNA-seq de célula única; Tarefa 3: Análise por citometria de fluxo dos subtipos de DC presentes no microambiente tumoral; Tarefa 4: Distribuições espaciais dos subtipos de DC no microambiente tumoral Tarefa 5: Avaliação da associação entre subtipos de células mielóides presentes no microambiente tumoral e sobrevida;

O estudo terminará com a análise bioinformática dos dados e a validação dos mesmos através de análises de citometria de fluxo