Eterogeneità delle cellule dendritiche nel cancro del colon e del polmone non a piccole cellule (TUM-DC)

BACKGROUND L'attivazione delle risposte immunitarie adattative dipende dalle cellule dendritiche (DC) e dai macrofagi, cellule mieloidi del sistema immunitario innato specializzate nella presentazione dell'antigene e nell'attivazione delle cellule T. Questa particolarità delle cellule mieloidi è fondamentale non solo durante le malattie infettive ma anche nel contesto del cancro, poiché i fagociti raccolgono gli antigeni associati alle cellule tumorali e li presentano alle cellule T all'interno del microambiente tumorale o nei linfonodi drenanti del tumore per ottenere risposte antitumorali .

In particolare, è stata osservata una correlazione positiva tra il contenuto tumorale complessivo di DC e la sopravvivenza di pazienti oncologici con tumori diversi, nonché una migliore reattività alle terapie basate sull'uso di inibitori dell'immunocheckpoint (ICB).

Recentemente è stata rivelata la presenza di diversi sottotipi di cellule dendritiche, nonché uno specifico adattamento di ciascun sottotipo all'ambiente tumorale.

Questo è un punto critico poiché l'eterogeneità funzionale di DC, macrofagi e cellule T nel microambiente tumorale è probabilmente uno dei fattori responsabili del successo o del fallimento delle immunoterapie antitumorali. Le terapie basate su ICB hanno rivoluzionato il trattamento dei pazienti con tumori, come il melanoma e il cancro ai polmoni, ma attualmente sono utili solo per una minoranza di pazienti. Migliorare la comprensione del microambiente immunitario del tumore è la chiave per prevedere le risposte cliniche alle terapie esistenti e possibilmente lo sviluppo di nuove immunoterapie.

RAZIONALE Le cellule mieloidi, come le cellule dendritiche ei macrofagi, si infiltrano in molti tipi diversi di tumori e possono esercitare una funzione antitumorale attivando le cellule T e NK, oppure possono svolgere un'attività pro-tumorale producendo citochine antinfiammatorie e molecole inibitorie. La presenza all'interno del tumore di diversi sottotipi di DC convenzionali è stata associata a una prognosi migliore mentre è stata proposta una funzione pro-tumorale per DC non convenzionali come CD14 + CD1c + DC. La presenza di macrofagi è stata associata ad un'azione protumorale.

I ricercatori ipotizzano che l'eterogeneità funzionale delle cellule mieloidi e delle cellule T all'interno del microambiente tumorale sia uno dei fattori responsabili del successo o del fallimento delle risposte immunitarie antitumorali. La definizione ad alta risoluzione dei sottotipi di cellule mieloidi e delle cellule T associate al tumore, il loro fenotipo, la distribuzione all'interno del tumore e le loro caratteristiche funzionali aiuteranno a comprendere la complessità del microambiente tumorale.

DISEGNO DELLO STUDIO Al momento del prelievo, ogni campione verrà identificato ed etichettato con un ID univoco. Il patologo preleverà il materiale e selezionerà il tessuto utilizzabile per l'esperimento dopo aver prelevato quanto necessario ai fini diagnostici. Il campione di ricerca verrà posto in provette e conservato in ghiaccio. Sarà poi inviato al laboratorio dell'Università di Milano-Bicocca. Il tumore verrà tagliato a pezzi e verranno preparate sospensioni unicellulari con il kit di dissociazione del tumore umano e il dissociatore gentleMACS ™ (Miltenyi Biotech) secondo il protocollo standard. Le sospensioni cellulari saranno quindi isolate mediante centrifugazione in gradiente di densità.

Gli investigatori analizzeranno circa 60 pazienti per studi di immunofluorescenza e 4 pazienti per analisi trascrittomiche a singola cellula (RNA-seq a singola cellula). L'analisi di una singola cellula eseguita da 4 pazienti si è già dimostrata sufficiente per identificare diversi sottotipi di cellule immunitarie. Le cellule immunitarie saranno trattate per ottenere una sospensione cellulare arricchita in cellule mieloidi. Ciò consentirà un'accurata analisi dei sottotipi di DC, macrofagi e cellule T CD4 + e di identificare anche popolazioni molto rare che potrebbero essere perse in campioni non selezionati a causa della diluizione. La strategia di pre-sorting sarà basata sull'espressione di CD45 e MHC di classe II e sull'assenza di espressione di CD3, CD19, CD56, Ly6G per escludere T, B, NK e neutrofili.

Il materiale residuo non verrà immagazzinato. Si presume che i pazienti saranno arruolati e analizzati per un periodo di 5 anni.

Ci sono 5 diverse attività:

Task1: Preparazione e sequenziamento della libreria RNA-seq a singola cellula; Compito 2: Analisi bioinformatica di singola cellula RNA-seq; Task 3: Analisi citofluorimetrica dei sottotipi di DC presenti nel microambiente tumorale; Task 4: Distribuzioni spaziali dei sottotipi di DC nel microambiente tumorale Task 5: Valutazione dell'associazione tra sottotipi di cellule mieloidi presenti nel microambiente tumorale e sopravvivenza;

Lo studio si concluderà con l'analisi bioinformatica dei dati e la validazione degli stessi mediante analisi citofluorimetriche