Heterogenita dendritických buněk u rakoviny tlustého střeva a nemalobuněčného karcinomu plic (TUM-DC)

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY Aktivace adaptivních imunitních odpovědí závisí na dendritických buňkách (DC) a makrofázích, myeloidních buňkách vrozeného imunitního systému specializovaných na prezentaci antigenu a na aktivaci T buněk. Tato zvláštnost myeloidních buněk je zásadní nejen při infekčních onemocněních, ale také v souvislosti s rakovinou, protože fagocyty zachycují antigeny asociované s rakovinnými buňkami a prezentují je T buňkám v nádorovém mikroprostředí nebo v lymfatických uzlinách odvádějících nádor, aby získaly protinádorovou odpověď. .

Zejména byla pozorována pozitivní korelace mezi celkovým obsahem nádorů DC a přežitím pacientů s rakovinou s různými nádory, stejně jako lepší reaktivita na terapie založené na použití inhibitorů imunocheckpointů (ICB).

Nedávno byla odhalena přítomnost různých subtypů dendritických buněk, stejně jako specifická adaptace každého subtypu na prostředí nádoru.

Toto je kritický bod, protože funkční heterogenita DC, makrofágů a T buněk v mikroprostředí nádoru je pravděpodobně jedním z faktorů odpovědných za úspěch nebo selhání protinádorových imunoterapií. Terapie založené na ICB způsobily revoluci v léčbě pacientů s rakovinou, jako je melanom a rakovina plic, ale v současnosti jsou prospěšné pouze pro menšinu pacientů. Zlepšení porozumění mikroprostředí nádorové imunity je klíčem k predikci klinických odpovědí na stávající terapie a možná i k vývoji nových imunoterapií.

ODŮVODNĚNÍ Myeloidní buňky, jako jsou dendritické buňky a makrofágy, infiltrují mnoho různých typů nádorů a mohou vykonávat protinádorovou funkci aktivací T a NK buněk nebo mohou vykonávat protumorovou aktivitu produkcí protizánětlivých cytokinů a inhibičních molekul. Přítomnost několika konvenčních DC subtypů v nádoru byla spojena s lepší prognózou, zatímco protumorová funkce byla navržena pro nekonvenční DC, jako je CD14 + CD1c + DC. Přítomnost makrofágů je spojována s protumorálním působením.

Výzkumníci předpokládají, že funkční heterogenita myeloidních buněk a T buněk v nádorovém mikroprostředí je jedním z faktorů odpovědných za úspěch nebo selhání protinádorových imunitních odpovědí. Vysoké rozlišení myeloidních buněčných subtypů a T lymfocytů asociovaných s nádorem, jejich fenotyp, distribuce v nádoru a také jejich funkční charakteristiky pomohou porozumět složitosti nádorového mikroprostředí.

NÁVRH STUDIE Při odběru bude každý vzorek identifikován a označen jedinečným ID. Patolog odebere vzorek materiálu a vybere tkáň, která může být použita pro experiment poté, co odebere vše, co je potřeba pro diagnostické účely. Výzkumný vzorek bude umístěn do zkumavek a uchováván na ledu. Poté bude zaslán do laboratoře University of Milano-Bicocca. Nádor se rozřeže na kousky a připraví se suspenze jednotlivých buněk pomocí soupravy pro disociaci lidského nádoru a disociátoru gentleMACS™ (Miltenyi Biotech) podle standardního protokolu. Buněčné suspenze se pak izolují centrifugací v hustotním gradientu.

Vyšetřovatelé budou analyzovat přibližně 60 pacientů pro imunofluorescenční studie a 4 pacienty pro jednobuněčné transkriptomické analýzy (single cell RNA-seq). Analýza jednotlivých buněk prováděná 4 pacienty se již ukázala jako dostatečná k identifikaci různých podtypů imunitních buněk. Imunitní buňky budou ošetřeny za účelem získání buněčné suspenze obohacené o myeloidní buňky. To umožní přesnou analýzu podtypů DC, makrofágů a CD4+ T buněk a identifikaci i velmi vzácných populací, které by mohly být ztraceny v neselektovaných vzorcích v důsledku ředění. Strategie předběžného třídění bude založena na expresi CD45 a MHC třídy II a na nepřítomnosti exprese CD3, CD19, CD56, Ly6G pro vyloučení T, B, NK a neutrofilů.

Zbytkový materiál nebude skladován. Předpokládá se, že pacienti budou zařazováni a analyzováni po dobu 5 let.

Existuje 5 různých úkolů:

Úkol 1: Příprava a sekvenování jednobuněčné RNA-seq knihovny; Úkol 2: Jednobuněčná RNA-seq bioinformatická analýza; Úkol 3: Analýza průtokovou cytometrií subtypů DC přítomných v mikroprostředí nádoru; Úkol 4: Prostorové distribuce subtypů DC v mikroprostředí nádoru Úkol 5: Hodnocení asociace mezi subtypy myeloidních buněk přítomných v mikroprostředí nádoru a přežití;

Studie bude zakončena bioinformatickou analýzou dat a jejich validací pomocí průtokových cytometrických analýz