Heterogeneidad de las células dendríticas en cáncer de colon y de pulmón de células no pequeñas (TUM-DC)

ANTECEDENTES La activación de las respuestas inmunitarias adaptativas depende de las células dendríticas (DC) y los macrófagos, células mieloides del sistema inmunitario innato especializadas en la presentación de antígenos y en la activación de células T. Esta peculiaridad de las células mieloides es fundamental no solo durante enfermedades infecciosas sino también en el contexto del cáncer, ya que los fagocitos captan antígenos asociados a las células cancerosas y se los presentan a las células T dentro del microambiente tumoral o en los ganglios linfáticos que drenan el tumor para obtener respuestas antitumorales. .

En particular, se observó una correlación positiva entre el contenido tumoral global de DC y la supervivencia de pacientes oncológicos con diferentes tumores, así como una mejor reactividad a terapias basadas en el uso de inmunoinhibidores de puntos de control (ICB).

Recientemente se ha puesto de manifiesto la presencia de diferentes subtipos de células dendríticas, así como una adaptación específica de cada subtipo al entorno tumoral.

Este es un punto crítico ya que la heterogeneidad funcional de las CD, macrófagos y células T en el microambiente tumoral es probablemente uno de los factores responsables del éxito o fracaso de las inmunoterapias contra el cáncer. Las terapias basadas en ICB han revolucionado el tratamiento de pacientes con cáncer, como el melanoma y el cáncer de pulmón, pero actualmente solo son beneficiosas para una minoría de pacientes. Mejorar la comprensión del microambiente inmunitario del tumor es la clave para predecir las respuestas clínicas a las terapias existentes y, posiblemente, el desarrollo de nuevas inmunoterapias.

FUNDAMENTO Las células mieloides, como las células dendríticas y los macrófagos, se infiltran en muchos tipos diferentes de tumores y pueden ejercer una función antitumoral al activar las células T y NK, o pueden llevar a cabo una actividad protumoral al producir citocinas antiinflamatorias y moléculas inhibidoras. La presencia dentro del tumor de varios subtipos de DC convencionales se ha asociado con un mejor pronóstico, mientras que se ha propuesto una función protumoral para DC no convencionales como CD14 + CD1c + DC. La presencia de macrófagos se ha asociado con una acción protumoral.

Los investigadores plantean la hipótesis de que la heterogeneidad funcional de las células mieloides y las células T dentro del microambiente tumoral es uno de los factores responsables del éxito o el fracaso de las respuestas inmunitarias antitumorales. La definición de alta resolución de los subtipos de células mieloides y las células T asociadas a tumores, su fenotipo, distribución dentro del tumor, así como sus características funcionales ayudarán a comprender la complejidad del microambiente tumoral.

DISEÑO DEL ESTUDIO Al momento de la recolección, cada muestra será identificada y etiquetada con una identificación única. El patólogo tomará una muestra del material y seleccionará el tejido que se puede utilizar para el experimento después de haber tomado todo lo necesario para fines de diagnóstico. La muestra de investigación se colocará en tubos de ensayo y se mantendrá en hielo. Luego será enviado al laboratorio de la Universidad de Milano-Bicocca. El tumor se cortará en pedazos y se prepararán suspensiones de células individuales con el kit de disociación de tumores humanos y el disociador gentleMACS™ (Miltenyi Biotech) de acuerdo con el protocolo estándar. A continuación, las suspensiones celulares se aislarán mediante centrifugación en gradiente de densidad.

Los investigadores analizarán aproximadamente 60 pacientes para estudios de inmunofluorescencia y 4 pacientes para análisis transcriptómicos de células individuales (RNA-seq de células individuales). El análisis de células individuales realizado por 4 pacientes ya ha demostrado ser suficiente para identificar diferentes subtipos de células inmunitarias. Las células inmunes serán tratadas para obtener una suspensión celular enriquecida en células mieloides. Esto permitirá un análisis preciso de subtipos de DC, macrófagos y células T CD4+ e identificar incluso poblaciones muy raras que podrían perderse en muestras no seleccionadas debido a la dilución. La estrategia de preclasificación se basará en la expresión de CD45 y MHC clase II y en la ausencia de expresión de CD3, CD19, CD56, Ly6G para excluir T, B, NK y neutrófilos.

El material residual no será almacenado. Se supone que los pacientes serán inscritos y analizados durante un período de 5 años.

Hay 5 tareas diferentes:

Tarea 1: preparación y secuenciación de la biblioteca de RNA-seq de una sola célula; Tarea 2: Análisis bioinformático de RNA-seq de una sola célula; Tarea 3: Análisis de citometría de flujo de los subtipos de DC presentes en el microambiente tumoral; Tarea 4: Distribuciones espaciales de los subtipos de DC en el microambiente tumoral Tarea 5: Evaluación de la asociación entre los subtipos de células mieloides presentes en el microambiente tumoral y la supervivencia;

El estudio finalizará con el análisis bioinformático de los datos y la validación de los mismos mediante análisis de citometría de flujo